24小时热门版块排行榜     意得辑论文翻译润色,首单减免200元

查看: 500  |  回复: 10
【悬赏金币】回答本帖问题,作者墨迹太深将赠送您 200 个金币

墨迹太深

木虫 (小有名气)

[求助] 小于100bp的DNA双酶切已有3人参与

我现在有一个已经合成了包含目的片段的质粒,要把目的片段从质粒(2802bp)上双酶切下来,酶切后跑胶看不到89bp的目的片段,但是能够看出来质粒已经没被线性化了,求分子生物学大神指导~
下面的图,泳道1是marker,泳道2是没有酶切的质粒,泳道3,4是双酶切后的质粒,看不到目的片段条带

小于100bp的DNA双酶切
2018-5-13.jpg@biostar2009@飞约疯人院@youlinglyw
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

用户晓晓

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2018-05-15 07:57:34
两个判断:
1,楼主应该标注清楚maker的大小,最下面的maker条带也已经不清晰了,说明跑胶时间比较长了。建议调整胶浓度2%-3%,跑胶时间不要太长,因为98bp的短条带跑的比较快,多观察几次,应该能观察到短条带的。

2,如果实在看不到短条带的存在,建议设置引物对目的片段进行PCR扩增测序来验证质粒是否包含正确的酶切位点和目的序列。

有问题欢迎讨论!

祝试验顺利!
2楼2018-05-14 16:30:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

墨迹太深

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 用户晓晓 at 2018-05-14 16:30:23
两个判断:
1,楼主应该标注清楚maker的大小,最下面的maker条带也已经不清晰了,说明跑胶时间比较长了。建议调整胶浓度2%-3%,跑胶时间不要太长,因为98bp的短条带跑的比较快,多观察几次,应该能观察到短条带的。 ...

你好,谢谢你的回复。

1.图片我已经修改了,关于marker,最下面一条是100bp,最上面三条是3000bp,2000bp,1500bp。

2.有一个问题想请教一下,我现在这样跑的时间,marker都还没跑开,如果再缩短时间,那marker岂不是跑不开了。

3.我不知道怎么给你金币唉,等我研究研究

谢谢层主

我是生物小白,望不吝赐教
小于100bp的DNA双酶切-1
2018-5-13.jpg

3楼2018-05-14 17:15:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

leister

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
从胶上看你的质粒应该是已经切好了,你的质粒大约是3kb。质粒的亮度与3000bp 的亮度基本一致,通常 marker 是100-200ng 一条带,你切出来的片段如果只有89bp 是质粒大小的1/30。照你上样的浓度,你切出来的量大致在10ng 左右,所以你染色看不到band。如果你是想切出来装到另一个质粒里的话,这个办法不好,用于酶切的质粒的量要大,并且胶回收的效率会很低。所有建议用 PCR 方法,高保真扩出来后直接过柱纯化,然后双酶切,再过柱纯化一次后与目的质粒做连接。注意双酶切后不用再费事去跑胶,会浪费巨量的样本。这么小的片段连接效率应该是非常高的。Good luck!
7楼2018-05-16 12:46:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

用户晓晓

金虫 (正式写手)

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-05-15 07:57:50
质粒比较大,你的目的前段又比较小,maker只要能判断大小即可。目前主要是为了能确定你的98bp的存在,所以建议设置2%的胶,100电压,跑个20到30分钟,中间多看看,同时可以再点一个maker I(100-600bp)。

发自小木虫Android客户端
4楼2018-05-14 17:26:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

大-木-虫

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-05-15 07:58:07
还是建议PCR扩增吧,并且对于小片段的回收要用高浓度的胶,不然容易弥散
5楼2018-05-14 17:50:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

大-木-虫

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

还是建议PCR扩增吧,并且对于小片段的回收要用高浓度的胶,不然容易弥散
6楼2018-05-14 17:50:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

学无止境111

新虫 (小有名气)

可以试试提高胶浓度,换个100bp左右的marker试试

发自小木虫IOS客户端
8楼2018-05-16 12:54:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

汐尔于

新虫 (正式写手)

片段太小,电泳只是粗略的判断,你试试PCR

发自小木虫Android客户端
9楼2018-08-11 16:51:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

乐乐卡卡西

新虫 (初入文坛)

用高浓度的胶,小电压跑看看

发自小木虫Android客户端
10楼2018-08-19 14:43:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 墨迹太深 的主题更新
不应助 确定回帖应助 (注意:应助才可能被奖励,但不允许灌水,必须填写15个字符以上)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 大家能说说听说过出去联培学校排名最靠后的拍到多少了呢? +12 Xismery 2019-01-18 12/600 2019-01-18 15:17 by ZTH1011
[论文投稿] IEEE ACCESS 拒稿,请问这样的意见还有必要重投吗? +3 黄晨 2019-01-17 11/550 2019-01-18 11:17 by editsprings
[有机交流] 请问哪里能买到炔丙醇? +5 sea0257 2019-01-16 8/400 2019-01-18 06:46 by zyp0009928
[论文投稿] SCI第一单位是我们学院的重点实验室可以吗? 50+7 2207800939 2019-01-12 36/1800 2019-01-17 23:07 by shejizhe07
[硕博家园] 面试完,老师没主动联系是不是就凉了? +9 StanleyW 2019-01-17 12/600 2019-01-17 23:02 by 123dingyc
[教师之家] 青椒or科技工作者?论青年教师成长的一些困惑~ (金币+2) +47 wonderful_me 2019-01-14 70/3500 2019-01-17 21:17 by lccj158
[分析] 日立液相跑了一晚上流动相不见少? +5 Vareni 2019-01-15 5/250 2019-01-17 19:33 by cjzhu
[公派出国] 拿到比较满意的offer后什么时候推掉其他的offer合适? +6 kkkukuqqt 2019-01-16 6/300 2019-01-17 15:53 by Lithiummm
[论文投稿] 审了3个月余,review结束两周,没结果,昨天晚上第一次催了个稿 +4 ybs0809 2019-01-16 4/200 2019-01-17 09:40 by gwl11818
[硕博家园] 论文该怎么下手 +5 adiosw 2019-01-16 10/500 2019-01-17 09:04 by jjyifan
[基金申请] 博士生、硕士生也要上传简历? +3 镜花书生 2019-01-16 5/250 2019-01-17 01:02 by salongbashi
[博后之家] 想做博后但是年纪超龄了 +14 rose_1844100 2019-01-14 19/950 2019-01-16 21:26 by 寒夜微曙
[有机交流] 对氯苯酚与苯甲酰氯的傅克酰基化反应 20+3 沐雪之月 2019-01-14 15/750 2019-01-16 14:36 by lc2633
[材料综合] 电池性能测试 +3 嘿,逗逗 2019-01-15 6/300 2019-01-16 11:26 by 嘿,逗逗
[有机交流] 油浴锅温度传感器 10+3 学徒紫影 2019-01-15 7/350 2019-01-16 06:55 by yuanjunmin
[访问学者] 到达大英帝国 +15 happylldog 2019-01-14 20/1000 2019-01-16 03:02 by 快乐平安
[有机交流] 酰氯的制备。 20+3 勤x好w爱助人 2019-01-13 10/500 2019-01-15 14:33 by ghj-hebust
[论文投稿] 投论文 +4 公子小白鲸 2019-01-14 4/200 2019-01-15 08:02 by dullrobber
[论文投稿] Bioresource Technology的稿件编号 4+4 冼亮淀粉酶 2019-01-12 8/400 2019-01-14 17:34 by 冼亮淀粉酶
[公派出国] 纠结 +3 安若蓝蓝蓝 2019-01-11 3/150 2019-01-12 00:39 by 16666cc
信息提示
请填处理意见