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墨迹太深

木虫 (小有名气)

[求助] 小于100bp的DNA双酶切已有3人参与

我现在有一个已经合成了包含目的片段的质粒,要把目的片段从质粒(2802bp)上双酶切下来,酶切后跑胶看不到89bp的目的片段,但是能够看出来质粒已经没被线性化了,求分子生物学大神指导~
下面的图,泳道1是marker,泳道2是没有酶切的质粒,泳道3,4是双酶切后的质粒,看不到目的片段条带

小于100bp的DNA双酶切
2018-5-13.jpg@biostar2009@飞约疯人院@youlinglyw
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用户晓晓

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2018-05-15 07:57:34
两个判断:
1,楼主应该标注清楚maker的大小,最下面的maker条带也已经不清晰了,说明跑胶时间比较长了。建议调整胶浓度2%-3%,跑胶时间不要太长,因为98bp的短条带跑的比较快,多观察几次,应该能观察到短条带的。

2,如果实在看不到短条带的存在,建议设置引物对目的片段进行PCR扩增测序来验证质粒是否包含正确的酶切位点和目的序列。

有问题欢迎讨论!

祝试验顺利!
2楼2018-05-14 16:30:23
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墨迹太深

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 用户晓晓 at 2018-05-14 16:30:23
两个判断:
1,楼主应该标注清楚maker的大小,最下面的maker条带也已经不清晰了,说明跑胶时间比较长了。建议调整胶浓度2%-3%,跑胶时间不要太长,因为98bp的短条带跑的比较快,多观察几次,应该能观察到短条带的。 ...

你好,谢谢你的回复。

1.图片我已经修改了,关于marker,最下面一条是100bp,最上面三条是3000bp,2000bp,1500bp。

2.有一个问题想请教一下,我现在这样跑的时间,marker都还没跑开,如果再缩短时间,那marker岂不是跑不开了。

3.我不知道怎么给你金币唉,等我研究研究

谢谢层主

我是生物小白,望不吝赐教
小于100bp的DNA双酶切-1
2018-5-13.jpg

3楼2018-05-14 17:15:40
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用户晓晓

金虫 (正式写手)

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-05-15 07:57:50
质粒比较大,你的目的前段又比较小,maker只要能判断大小即可。目前主要是为了能确定你的98bp的存在,所以建议设置2%的胶,100电压,跑个20到30分钟,中间多看看,同时可以再点一个maker I(100-600bp)。

发自小木虫Android客户端
4楼2018-05-14 17:26:25
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大-木-虫

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-05-15 07:58:07
还是建议PCR扩增吧,并且对于小片段的回收要用高浓度的胶,不然容易弥散
5楼2018-05-14 17:50:09
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大-木-虫

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

还是建议PCR扩增吧,并且对于小片段的回收要用高浓度的胶,不然容易弥散
6楼2018-05-14 17:50:19
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leister

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
从胶上看你的质粒应该是已经切好了,你的质粒大约是3kb。质粒的亮度与3000bp 的亮度基本一致,通常 marker 是100-200ng 一条带,你切出来的片段如果只有89bp 是质粒大小的1/30。照你上样的浓度,你切出来的量大致在10ng 左右,所以你染色看不到band。如果你是想切出来装到另一个质粒里的话,这个办法不好,用于酶切的质粒的量要大,并且胶回收的效率会很低。所有建议用 PCR 方法,高保真扩出来后直接过柱纯化,然后双酶切,再过柱纯化一次后与目的质粒做连接。注意双酶切后不用再费事去跑胶,会浪费巨量的样本。这么小的片段连接效率应该是非常高的。Good luck!
7楼2018-05-16 12:46:57
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学无止境111

新虫 (初入文坛)

可以试试提高胶浓度,换个100bp左右的marker试试

发自小木虫IOS客户端
8楼2018-05-16 12:54:13
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