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xyz_su

新虫 (初入文坛)

[交流] PCR扩不出条带,跑电泳产物弥散,求大神指点啊,已有8人参与

为什么我的PCR总是扩不出条带,想到了一些原因,也试了,但是总是弥散。不知道是什么情况。引物退火温度是58.2,我的PCR做了梯度,58,60,62换了温度,没有改善,换过不同的酶mix,高保真,Taq都用过,模板是做了梯度,1,3,6,10.5。有几次莫名的出来条带,是在我的理论范围,重复了几次,是在梯度60退火,10.5的模板,因为是模板之前稀释到250纳克每微升,所以25微体系是用了10.5微,在这个梯度上出现了条带,但是胶回收了产物,用此DNA做模板却又扩不出来,重复不出来。每次marker都没有问题,但就是PCR产物弥散,没有条带。做了10天左右,重复做了很多条件,不知道为什么一直弥散,请大神指点啊,最开始的一步做不出来,后面的实验不知道什么时候才能做

PCR扩不出条带,跑电泳产物弥散,求大神指点啊,


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wxm0212

新虫 (正式写手)

★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-04-13 07:54:00
降低退火温度试试,可以用touchdown程序,而且你这引物二聚体都木有,引物不知道有木有将解,DNA不知道质量怎么样,但是用的量太大如果质量好的话,以你稀释后的浓度加1微升就够了

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2楼2018-04-12 21:30:22
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就是柚子啊!

新虫 (正式写手)

引物设计得好吗

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» 本帖已获得的红花(最新10朵)

3楼2018-04-12 21:37:20
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xyz_su

新虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by wxm0212 at 2018-04-12 21:30:22
降低退火温度试试,可以用touchdown程序,而且你这引物二聚体都木有,引物不知道有木有将解,DNA不知道质量怎么样,但是用的量太大如果质量好的话,以你稀释后的浓度加1微升就够了
...

太感谢了,我的退火温度一开始也试过55度57度,后来做了 58,60,62度的梯度,出了条带,结果又重复不出来,再跑又是弥散。用PCR产物做了10倍,20倍,50倍,100倍,1000倍,而且我的cDNA的模板不纯,所以一般用量都是3微以上的梯度。引物没有做过梯度,一般都是20微摩,用1微,在25微体系中。还有一个现象,之前跑的时候是没有弥散,前几次跑的时候,有一条大小不对的条带和引物二聚体,自从一次用pcr产物之后,就一直弥散,而marker不弥散,用了新反转录出的cDNA还是弥散。

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4楼2018-04-12 21:56:49
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xyz_su

新虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 就是柚子啊! at 2018-04-12 21:37:20
引物设计得好吗

引物就是,前引物是前面取一段,后面一段反向互补,前引物后引物温度均为58.2,GC是61.1和47.6,长度为18和21,用DNAMAN设计,特异性在NCBI上我看过一次,不会看,用的是primer blast.我的引物是刚合成的,感觉应该不会有问题,但也不确定

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5楼2018-04-12 22:01:46
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xyz_su

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wxm0212 at 2018-04-12 21:30:22
降低退火温度试试,可以用touchdown程序,而且你这引物二聚体都木有,引物不知道有木有将解,DNA不知道质量怎么样,但是用的量太大如果质量好的话,以你稀释后的浓度加1微升就够了
...

我没有touch down ,我们实验室只有普通的PCR仪

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6楼2018-04-12 22:02:42
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幻夜落雪

银虫 (小有名气)

★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-04-13 07:54:21
没有touch down ,可以分两次PCR来做,第一次循环数少,第二轮循环数多一点,
还有我觉得很大可能模板不行,重新制备模板吧
7楼2018-04-12 23:13:03
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zyz2007

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
感觉dna加的太多了,体系一半 dna质量怎么样?

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8楼2018-04-13 06:45:54
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xyz_su

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by zyz2007 at 2018-04-13 06:45:54
感觉dna加的太多了,体系一半 dna质量怎么样?

就是感觉可能是DNA质量不好,RNA提完没有跑电泳,反转录完测纯度不是很好。有的1.7几,有的1.6几,还有1.5几的,也不知道260/280值为多少能用

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9楼2018-04-13 08:07:33
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问晴天

新虫 (初入文坛)


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PCR挺简单的,只是你后来自己弄复杂了,模板质量(不是很重要)、引物(重要),反应条件和体系,这三个搞好就行了
10楼2018-04-13 09:18:37
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