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PCR扩不出条带，跑电泳产物弥散，求大神指点啊，已有8人参与
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为什么我的PCR总是扩不出条带，想到了一些原因，也试了，但是总是弥散。不知道是什么情况。引物退火温度是58.2，我的PCR做了梯度，58，60，62换了温度，没有改善，换过不同的酶mix，高保真，Taq都用过，模板是做了梯度，1，3，6，10.5。有几次莫名的出来条带，是在我的理论范围，重复了几次，是在梯度60退火，10.5的模板，因为是模板之前稀释到250纳克每微升，所以25微体系是用了10.5微，在这个梯度上出现了条带，但是胶回收了产物，用此DNA做模板却又扩不出来，重复不出来。每次marker都没有问题，但就是PCR产物弥散，没有条带。做了10天左右，重复做了很多条件，不知道为什么一直弥散，请大神指点啊，最开始的一步做不出来，后面的实验不知道什么时候才能做 发自小木虫Android客户端 |
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-04-13 07:54:00
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-04-13 07:54:00
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降低退火温度试试，可以用touchdown程序，而且你这引物二聚体都木有，引物不知道有木有将解，DNA不知道质量怎么样，但是用的量太大如果质量好的话，以你稀释后的浓度加1微升就够了 发自小木虫Android客户端 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
2楼2018-04-12 21:30:22
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就是感觉可能是DNA质量不好，RNA提完没有跑电泳，反转录完测纯度不是很好。有的1.7几，有的1.6几，还有1.5几的，也不知道260/280值为多少能用 发自小木虫Android客户端 |
9楼2018-04-13 08:07:33
3楼2018-04-12 21:37:20
送红花一朵|
太感谢了，我的退火温度一开始也试过55度57度，后来做了 58，60，62度的梯度，出了条带，结果又重复不出来，再跑又是弥散。用PCR产物做了10倍，20倍，50倍，100倍，1000倍，而且我的cDNA的模板不纯，所以一般用量都是3微以上的梯度。引物没有做过梯度，一般都是20微摩，用1微，在25微体系中。还有一个现象，之前跑的时候是没有弥散，前几次跑的时候，有一条大小不对的条带和引物二聚体，自从一次用pcr产物之后，就一直弥散，而marker不弥散，用了新反转录出的cDNA还是弥散。 发自小木虫Android客户端 |
4楼2018-04-12 21:56:49
送红花一朵|
引物就是，前引物是前面取一段，后面一段反向互补，前引物后引物温度均为58.2，GC是61.1和47.6，长度为18和21，用DNAMAN设计，特异性在NCBI上我看过一次，不会看，用的是primer blast.我的引物是刚合成的，感觉应该不会有问题，但也不确定 发自小木虫Android客户端 |
5楼2018-04-12 22:01:46
6楼2018-04-12 22:02:42
7楼2018-04-12 23:13:03
zyz2007
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dna质量怎么样？8楼2018-04-13 06:45:54
10楼2018-04-13 09:18:37
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