24小时热门版块排行榜     中国微生物培养皿艺术大赛

查看: 850  |  回复: 17

xyz_su

新虫 (初入文坛)

[交流] PCR扩不出条带,跑电泳产物弥散,求大神指点啊,已有8人参与

为什么我的PCR总是扩不出条带,想到了一些原因,也试了,但是总是弥散。不知道是什么情况。引物退火温度是58.2,我的PCR做了梯度,58,60,62换了温度,没有改善,换过不同的酶mix,高保真,Taq都用过,模板是做了梯度,1,3,6,10.5。有几次莫名的出来条带,是在我的理论范围,重复了几次,是在梯度60退火,10.5的模板,因为是模板之前稀释到250纳克每微升,所以25微体系是用了10.5微,在这个梯度上出现了条带,但是胶回收了产物,用此DNA做模板却又扩不出来,重复不出来。每次marker都没有问题,但就是PCR产物弥散,没有条带。做了10天左右,重复做了很多条件,不知道为什么一直弥散,请大神指点啊,最开始的一步做不出来,后面的实验不知道什么时候才能做

PCR扩不出条带,跑电泳产物弥散,求大神指点啊,


发自小木虫Android客户端
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wxm0212

新虫 (正式写手)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-04-13 07:54:00
降低退火温度试试,可以用touchdown程序,而且你这引物二聚体都木有,引物不知道有木有将解,DNA不知道质量怎么样,但是用的量太大如果质量好的话,以你稀释后的浓度加1微升就够了

发自小木虫Android客户端

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

2楼2018-04-12 21:30:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

就是柚子啊!

新虫 (小有名气)

引物设计得好吗

发自小木虫Android客户端

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

3楼2018-04-12 21:37:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xyz_su

新虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by wxm0212 at 2018-04-12 21:30:22
降低退火温度试试,可以用touchdown程序,而且你这引物二聚体都木有,引物不知道有木有将解,DNA不知道质量怎么样,但是用的量太大如果质量好的话,以你稀释后的浓度加1微升就够了
...

太感谢了,我的退火温度一开始也试过55度57度,后来做了 58,60,62度的梯度,出了条带,结果又重复不出来,再跑又是弥散。用PCR产物做了10倍,20倍,50倍,100倍,1000倍,而且我的cDNA的模板不纯,所以一般用量都是3微以上的梯度。引物没有做过梯度,一般都是20微摩,用1微,在25微体系中。还有一个现象,之前跑的时候是没有弥散,前几次跑的时候,有一条大小不对的条带和引物二聚体,自从一次用pcr产物之后,就一直弥散,而marker不弥散,用了新反转录出的cDNA还是弥散。

发自小木虫Android客户端
4楼2018-04-12 21:56:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xyz_su

新虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 就是柚子啊! at 2018-04-12 21:37:20
引物设计得好吗

引物就是,前引物是前面取一段,后面一段反向互补,前引物后引物温度均为58.2,GC是61.1和47.6,长度为18和21,用DNAMAN设计,特异性在NCBI上我看过一次,不会看,用的是primer blast.我的引物是刚合成的,感觉应该不会有问题,但也不确定

发自小木虫Android客户端
5楼2018-04-12 22:01:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xyz_su

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wxm0212 at 2018-04-12 21:30:22
降低退火温度试试,可以用touchdown程序,而且你这引物二聚体都木有,引物不知道有木有将解,DNA不知道质量怎么样,但是用的量太大如果质量好的话,以你稀释后的浓度加1微升就够了
...

我没有touch down ,我们实验室只有普通的PCR仪

发自小木虫Android客户端
6楼2018-04-12 22:02:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

幻夜落雪

银虫 (小有名气)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-04-13 07:54:21
没有touch down ,可以分两次PCR来做,第一次循环数少,第二轮循环数多一点,
还有我觉得很大可能模板不行,重新制备模板吧
7楼2018-04-12 23:13:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zyz2007

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
感觉dna加的太多了,体系一半 dna质量怎么样?

发自小木虫IOS客户端
8楼2018-04-13 06:45:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xyz_su

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by zyz2007 at 2018-04-13 06:45:54
感觉dna加的太多了,体系一半 dna质量怎么样?

就是感觉可能是DNA质量不好,RNA提完没有跑电泳,反转录完测纯度不是很好。有的1.7几,有的1.6几,还有1.5几的,也不知道260/280值为多少能用

发自小木虫Android客户端
9楼2018-04-13 08:07:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

问晴天

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
PCR挺简单的,只是你后来自己弄复杂了,模板质量(不是很重要)、引物(重要),反应条件和体系,这三个搞好就行了
10楼2018-04-13 09:18:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 xyz_su 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[论文投稿] ACS会在周末返审稿意见吗 +6 好啊好的 2018-07-21 6/300 2018-07-22 08:33 by nono2009
[基金申请] 看着大家忙着申请基金,我脑子里确是另一件比事情 +76 灰分好高 2018-07-20 106/5300 2018-07-22 06:10 by 大美女
[育儿交流] 研究生妈妈要去复学 +9 幸运的小菲菲 2018-07-20 11/550 2018-07-22 01:18 by asnowyear
[基金申请] 浙江省基金外审结果明天会出来吗? +13 环球梅子 2018-07-18 26/1300 2018-07-21 23:31 by ibaojr
[基金申请] 看来,今年是管的严,各学部能打听到结果的,是极少数。 +6 lovestory88 2018-07-20 7/350 2018-07-21 23:15 by zuiaimama
[考博] 导师这样回复可能性大吗? +14 18722079315 2018-07-21 17/850 2018-07-21 20:10 by 736156374
[教师之家] 读博学什么专业好找高校的工作? +7 归船系浅渡 2018-07-18 14/700 2018-07-21 14:45 by yzp06233
[文学芳草园] 叶散的时候,明白欢聚;花谢的时候,明白青春。 +22 青栀_428 2018-07-17 48/2400 2018-07-21 08:00 by 李小华
[论文投稿] 在physics report上面发表文章了,怎么样 +3 无法被遗忘 2018-07-20 8/400 2018-07-20 23:42 by 无法被遗忘
[论文投稿] 有哪些 混凝土材料 类的核心期刊 速度比较快的? +3 zhf0712 2018-07-20 3/150 2018-07-20 23:02 by 逝水无痕1990
[论文投稿] 审稿人提出很多语法问题,必须point to point 回复么? 2+3 521gang 2018-07-18 11/550 2018-07-20 16:31 by 我是WAITMDAL
[基金申请] 整个论坛风声鹤唳 +10 voncedar 2018-07-20 10/500 2018-07-20 13:07 by dahama
[硕博家园] day4 补充 +5 爱喝酸奶呀 2018-07-19 6/300 2018-07-19 23:16 by 号外麦片,,
[基金申请] 医学二审 +4 Zhai-lucky 2018-07-19 4/200 2018-07-19 21:17 by hexr08
[公派出国] 德国亚琛工业大学生物技术系Ulrich Schwaneberg教授招收公派生 +7 闹闹爱学习 2018-07-17 11/550 2018-07-19 00:11 by 朱润涛
[硕博家园] 本硕毕业证书丢了,该怎么办 +11 渣渣鱼? 2018-07-16 11/550 2018-07-18 17:16 by 没事乱翻书
[论文投稿] 推荐一下一区的影响因子不高的好投的期刊(是电化学方向的) +7 李梦琳210 2018-07-17 7/350 2018-07-18 16:00 by kevin游人
[访问学者] 2018CSC地方项目结果出来啦1 +4 xyfxl123 2018-07-17 5/250 2018-07-17 20:51 by rockymu
[硕博家园] 光催化分解水的设备? +4 Qiaokun123 2018-07-16 4/200 2018-07-17 13:11 by iorilst
[基金申请] 几个A能上会啊 +8 nihao1050 2018-07-16 11/550 2018-07-16 17:34 by linjx2000
信息提示
请填处理意见