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原清凡

新虫 (初入文坛)

[求助] 转录组和RACE相关问题已有1人参与

以转录组数据的序列扩增基因,以转录组序列为模板,在它50-1000bp的位置设计了扩增中间片段的引物,测序出来了没问题,然后在300左右的位置设计了5'RACE的引物,测序出来了,在5'端也找到了UPM的长引物,但是它整个长度在100-300的位置,明明中间片段已经做出来了,为什么5'RACE会出现这样的情况,求大神解答

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hanxiaominhu

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
有可能是RNA提取和处理的问题。最好先比对一下中间片段,预估一下缺多少。

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2楼2018-02-04 08:33:09
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分子我

新虫 (初入文坛)

5‘引物跑完条带也是不到300bp么

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3楼2018-02-04 16:09:41
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原清凡

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 分子我 at 2018-02-04 16:09:41
5‘引物跑完条带也是不到300bp么

是的200左右,说明5'端应该就是从这开始的,但我前面设计的扩中间片段的引物跑出来测序出来都没问题,序列也和转录组的一样。实在不清楚原因

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4楼2018-02-04 21:21:26
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原清凡

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by hanxiaominhu at 2018-02-04 08:33:09
有可能是RNA提取和处理的问题。最好先比对一下中间片段,预估一下缺多少。

我测了两个基因的序列,一个3kb左右一个6kb左右,中间片段都没问题,只是相差几个碱基,但它们的5'端都遇到了我上面说的问题。
我跑中间片段的cDNA和RACE库都是用的同一份RNA,当时跑胶都有三条带,而且260/280和260/230都在正常的范围内。

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5楼2018-02-04 21:27:21
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hanxiaominhu

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 原清凡 at 2018-02-04 21:27:21
我测了两个基因的序列,一个3kb左右一个6kb左右,中间片段都没问题,只是相差几个碱基,但它们的5'端都遇到了我上面说的问题。
我跑中间片段的cDNA和RACE库都是用的同一份RNA,当时跑胶都有三条带,而且260/280和2 ...

你的5’端应该有多少,是不是已经全了。

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6楼2018-02-04 21:41:47
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Ivy尘

新虫 (正式写手)

如果不全,说明RNA不够完整,所以5’ 端不全

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7楼2018-02-10 16:52:57
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5斤亲戚

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 原清凡 at 2018-02-04 21:21:26
是的200左右,说明5'端应该就是从这开始的,但我前面设计的扩中间片段的引物跑出来测序出来都没问题,序列也和转录组的一样。实在不清楚原因
...

楼主我也有这方面的问题,方便的话,可以加个QQ讨论一下么965092653

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8楼2019-03-15 17:18:31
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