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一点就通，Trizol法提取RNA教程来一套已有4人参与
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一. 实验原理 Trizol内含异硫氰酸胍能迅速破碎细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性并释放出核酸；由于释放出的DNA和RNA在特定pH值下的溶解度不同，且分别位于中间相和水相，从而使DNA和RNA得到分离；取出水相后，通过有机溶剂(氯仿)抽提及异丙醇沉淀，可得到纯净RNA。 二. 操作步骤 1．通过离心来沉淀细胞后，弃上清，用移液管加TRIZOL试剂反复吹打来裂解细胞至均一通亮的液态后，将匀浆样品在15—30°C 条件下孵育5 分钟以使核蛋白体完全分解。（每5—10×106的动物细胞，植物或酵母菌细胞或每1×107 细菌加1ml的TRIZOL。在加入TRIZOL前应避免洗涤细胞因为那样会增加mRNA降解的可能性。） 2．分离阶段 每1 mlTRIZOL 加0.2 ml 氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15 秒并将其在30°C 下孵育2—3 分钟。在2—8°C 下以不超过12,000×g 的离心力高速冷冻离心15 分钟。离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA 无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加TRIZOL 容量的60% 3．RNA的沉淀 将水样层转移到一干净的试管中，通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。最初均化时的每1 mlTRIZOL 对应0.5 ml 异丙醇。将混合的样品在 15—30°C 条件下孵育10 分钟并在2—8°C 下以不超过12,000×g 的离心力高速冷冻离心10 分钟。RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。 4．RNA的洗脱 移去上层悬液。用75%的乙醇洗涤RNA 沉淀一次，每1 ml 的TRIZOL 至少加1 ml 的75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在2—8°C 下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5 分钟。 5．RNA的再溶解 在操作的最后，简单干燥RNA沉淀。尤为重要的是，不能让RNA沉淀完全干燥那样会极大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA样品其A260/280 比值< 1.6。用移液管尖分几次移取无RNA酶的水或0.5% SDS溶液来溶解RNA，并在55—60°C下孵育10 分钟。 三. 注意事项 1．样品量和 Trizol 的加入量一定要按以上的比例，不能随意增加样品量或减少 Trizol 量，否则会使内源性 RNase 的抑制不完全，导致 RNA 降解。 2．整个过程要及时更换手套，戴双层口罩，并在操作区开启酒精灯。 3．RNA一定要贮存到-80℃冰箱，在-20℃保存时间很短。 4．配制的溶液应用灭菌处理的DEPC水。 5．玻璃器皿可以在150°C 的烘箱中烘烤4 小时。塑料器皿可以在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。 |
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