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籣103103

新虫 (小有名气)

[交流] 一点就通,Trizol法提取RNA教程来一套已有3人参与

一. 实验原理
Trizol内含异硫氰酸胍能迅速破碎细胞,同时使核蛋白复合体中的蛋白变性并释放出核酸;由于释放出的DNA和RNA在特定pH值下的溶解度不同,且分别位于中间相和水相,从而使DNA和RNA得到分离;取出水相后,通过有机溶剂(氯仿)抽提及异丙醇沉淀,可得到纯净RNA。

二. 操作步骤
1.通过离心来沉淀细胞后,弃上清,用移液管加TRIZOL试剂反复吹打来裂解细胞至均一通亮的液态后,将匀浆样品在15—30°C 条件下孵育5 分钟以使核蛋白体完全分解。(每5—10×106的动物细胞,植物或酵母菌细胞或每1×107 细菌加1ml的TRIZOL。在加入TRIZOL前应避免洗涤细胞因为那样会增加mRNA降解的可能性。)

2.分离阶段
每1 mlTRIZOL 加0.2 ml 氯仿。盖紧样品管盖,用手用力摇晃试管15 秒并将其在30°C 下孵育2—3 分钟。在2—8°C 下以不超过12,000×g 的离心力高速冷冻离心15 分钟。离心后混合物分成三层:下层红色的苯酚-氯仿层,中间层,上层无色的水样层。RNA 无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加TRIZOL 容量的60%

3.RNA的沉淀
将水样层转移到一干净的试管中,通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。最初均化时的每1 mlTRIZOL 对应0.5 ml 异丙醇。将混合的样品在 15—30°C 条件下孵育10 分钟并在2—8°C 下以不超过12,000×g 的离心力高速冷冻离心10 分钟。RNA沉淀在离心前通常不可见,形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。

4.RNA的洗脱
移去上层悬液。用75%的乙醇洗涤RNA 沉淀一次,每1 ml 的TRIZOL 至少加1 ml 的75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在2—8°C 下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5 分钟。

5.RNA的再溶解
在操作的最后,简单干燥RNA沉淀。尤为重要的是,不能让RNA沉淀完全干燥那样会极大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA样品其A260/280 比值< 1.6。用移液管尖分几次移取无RNA酶的水或0.5% SDS溶液来溶解RNA,并在55—60°C下孵育10 分钟。

三. 注意事项
1.样品量和 Trizol 的加入量一定要按以上的比例,不能随意增加样品量或减少 Trizol 量,否则会使内源性 RNase 的抑制不完全,导致 RNA 降解。  

2.整个过程要及时更换手套,戴双层口罩,并在操作区开启酒精灯。

3.RNA一定要贮存到-80℃冰箱,在-20℃保存时间很短。

4.配制的溶液应用灭菌处理的DEPC水。

5.玻璃器皿可以在150°C 的烘箱中烘烤4 小时。塑料器皿可以在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟,用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
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细胞检测,蛋白检测,Western-blot,ELISA检测,PCR,基因检测,组织学检测,病毒学,微生物,动物实验等专业实验
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谢谢分享!

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2楼2017-10-13 17:18:21
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籣103103

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by sqd121xj at 2017-10-13 17:18:21
谢谢分享!

不客气,对你有用就好
细胞检测,蛋白检测,Western-blot,ELISA检测,PCR,基因检测,组织学检测,病毒学,微生物,动物实验等专业实验
3楼2017-10-13 17:39:05
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胡爽157

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
30度,会不会增加RNA酶降解RNA的几率?

发自小木虫Android客户端
4楼2017-10-13 21:26:36
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游离琳ing

新虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
请问在-80℃下RNA能保存多久
5楼2017-10-18 21:24:15
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