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林小露

铜虫 (初入文坛)


[求助] 设计引物遇到难题已有3人参与

本人扩增的序列为946bp,21-608为CDS,以下为基因序列;

        1 agaagaaccc gacaccagaa atggagaaga aattgtttgg tatcgcttta ctcttaacta

       61 ctgtagcctc agttttggcc gccgatacaa acgccccaat atgtctttgt gacgagccag

      121 gagttctagg acggactcag atcgtgacga cggagattaa agataagatc gagaaagctg

      181 tcgaagctgt tgcacaagag agtggtgtat caggaagagg attttctata ttttctcatc

      241 atcctgtgtt cagggaatgt ggcaaatacg agtgtcgaac cgtgaggcct gaacacagcc

      301 gttgctataa ctttcccccg tttattcatt tcaagtcaga atgccctgtt tcaactcgag

      361 actgtgagcc agtatttggt tatacggtag caggagagtt tagggttatt gtacaggctc

      421 caagggctgg gtttagacag tgtgtgtggc aacataagtg tcgattcggt agtaacagct

      481 gtggttataa tgggaggtgt actcagcaga ggtcagtggt tcgtttggtg acctacaact

      541 tggagaaaga cggtttcttg tgtgaaagct tccgaacatg ctgtggttgt ccttgtcgta

      601 gtttttaagc ctaactcatg ggttttagtt cttaagtcta actcattaag actaaattgt

      661 taagccaaac tcatgagttt agacacaagg attattcagt actatctttg caaatattac

      721 tttttgattg ttagtttcga caaattaacg atgcttgttc aaattttaaa accttctaaa

      781 ctacagaact aacattcagt aaaatataat ttgatttcgt aattacaata agaacgtaac

      841 atgtattgtt atcaccttct ccatccaatc attttttata ctctgtatga ataaaatact

      901 gtatggaatg tactttgtac aataaagtta aatatatatc tatgcc

用pp5设计引物,设计条件上游引物在1-20bp内,下游引物在609-946bp内。引物长度在18-21内均试过,得到的上下游引物Tm值相差非常大,上下游引物的GC含量相差也很大,条件很不好,不懂的应该怎么改条件,按照网上的说法改了条件还是不好,求大神赐教!!!
标签: 蛋白质组学
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kentyu

金虫 (正式写手)

可以长一点,保证两条引物的TM值相差在5度以内

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2楼2017-10-12 17:26:21
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林小露

铜虫 (初入文坛)


引用回帖:
2楼: Originally posted by kentyu at 2017-10-12 17:26:21
可以长一点,保证两条引物的TM值相差在5度以内

谢谢您的回复啊。本人是新手,这个一整段基因序列长度就是946bp,我是想扩增出来表达蛋白质的。请问如何长一点呢?不懂
3楼2017-10-12 20:04:20
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晋鹏

版主 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-10-13 07:49:10
如果已经有CDS。
为什么还需要引物呢?

直接P全长就好了。
及时行乐,人生不留遗憾!
4楼2017-10-12 20:49:15
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kentyu

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 林小露 at 2017-10-12 20:04:20
谢谢您的回复啊。本人是新手,这个一整段基因序列长度就是946bp,我是想扩增出来表达蛋白质的。请问如何长一点呢?不懂...

引物的长度呀,不是基因的长度

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5楼2017-10-12 22:18:15
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wareer

铜虫 (小有名气)


上下游直接取,只要Tm相近即可,不用管长度

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6楼2017-10-12 22:39:57
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didongwei

金虫 (正式写手)

你上游引物在1一20bp选?那基本上是没得选呀。你的实验目的是什么?

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不是优秀,而是不可替代
7楼2017-10-12 23:12:58
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林小露

铜虫 (初入文坛)


引用回帖:
4楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-10-12 20:49:15
如果已经有CDS。
为什么还需要引物呢?

直接P全长就好了。

有了CDS就不用引物了吗?PCR不都要引物吗?我目的就是想要全长,求大神赐教

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8楼2017-10-13 09:28:43
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林小露

铜虫 (初入文坛)


引用回帖:
5楼: Originally posted by kentyu at 2017-10-12 22:18:15
引物的长度呀,不是基因的长度
...

哦哦哦哦,21位开始就是起始密码子,我看到有些文章上面说要克隆全长引物就要设置在起始密码子前面,不太懂原理,求赐教

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9楼2017-10-13 09:30:46
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林小露

铜虫 (初入文坛)


引用回帖:
7楼: Originally posted by didongwei at 2017-10-12 23:12:58
你上游引物在1一20bp选?那基本上是没得选呀。你的实验目的是什么?

我的目的是克隆一整段基因序列然后成功表达,求大神赐教

发自小木虫IOS客户端
10楼2017-10-13 09:31:47
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