24小时热门版块排行榜     中国微生物培养皿艺术大赛

查看: 1900  |  回复: 38
【悬赏金币】回答本帖问题,作者林小露将赠送您 15 个金币

林小露

铜虫 (小有名气)

[求助] 设计引物遇到难题已有3人参与

本人扩增的序列为946bp,21-608为CDS,以下为基因序列;

        1 agaagaaccc gacaccagaa atggagaaga aattgtttgg tatcgcttta ctcttaacta

       61 ctgtagcctc agttttggcc gccgatacaa acgccccaat atgtctttgt gacgagccag

      121 gagttctagg acggactcag atcgtgacga cggagattaa agataagatc gagaaagctg

      181 tcgaagctgt tgcacaagag agtggtgtat caggaagagg attttctata ttttctcatc

      241 atcctgtgtt cagggaatgt ggcaaatacg agtgtcgaac cgtgaggcct gaacacagcc

      301 gttgctataa ctttcccccg tttattcatt tcaagtcaga atgccctgtt tcaactcgag

      361 actgtgagcc agtatttggt tatacggtag caggagagtt tagggttatt gtacaggctc

      421 caagggctgg gtttagacag tgtgtgtggc aacataagtg tcgattcggt agtaacagct

      481 gtggttataa tgggaggtgt actcagcaga ggtcagtggt tcgtttggtg acctacaact

      541 tggagaaaga cggtttcttg tgtgaaagct tccgaacatg ctgtggttgt ccttgtcgta

      601 gtttttaagc ctaactcatg ggttttagtt cttaagtcta actcattaag actaaattgt

      661 taagccaaac tcatgagttt agacacaagg attattcagt actatctttg caaatattac

      721 tttttgattg ttagtttcga caaattaacg atgcttgttc aaattttaaa accttctaaa

      781 ctacagaact aacattcagt aaaatataat ttgatttcgt aattacaata agaacgtaac

      841 atgtattgtt atcaccttct ccatccaatc attttttata ctctgtatga ataaaatact

      901 gtatggaatg tactttgtac aataaagtta aatatatatc tatgcc

用pp5设计引物,设计条件上游引物在1-20bp内,下游引物在609-946bp内。引物长度在18-21内均试过,得到的上下游引物Tm值相差非常大,上下游引物的GC含量相差也很大,条件很不好,不懂的应该怎么改条件,按照网上的说法改了条件还是不好,求大神赐教!!!
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

mlxmiao

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
随便帮你选了一段序列,具体可以参照NCBI上的在线软件
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/too ... enH61LOZlpB7Ldr8Dyg
设计引物遇到难题
大.png

14楼2017-10-13 12:03:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

didongwei

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by 林小露 at 2017-10-13 17:33:08
我是想采用酶切法得到扩增后的目的基因进行表达,如果需要使用酶切法,设计引物一定要从密码子开始设计引物吗?那下游引物也要设计在终止密码子前面咯?...

嗯,如果不做融合蛋白,就加上终止密码子,如果做融合蛋白,就去掉终止密码子。

发自小木虫IOS客户端
不是优秀,而是不可替代
17楼2017-10-13 19:01:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

didongwei

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
20楼: Originally posted by 林小露 at 2017-10-13 20:01:16
如果我要用酶切法。然后引物设计在起始密码子和终止密码子两侧,这样可以吗/,因为设计在两侧的引物条件貌似比在起始、终止密码子上设计的引物好一点...

如果用酶切法做,还要加酶切位点和保护碱基,设计好后单条引物长度不要大于35bp就行,设计这种载体引物不用考虑那么多,设计出来试就可以了。另外载体引物一般不会像你说的在两侧设计……

发自小木虫IOS客户端
不是优秀,而是不可替代
23楼2017-10-13 22:25:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

didongwei

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
24楼: Originally posted by 林小露 at 2017-10-14 09:00:11
那么设计出来后两者的Tm值相差太大的话,PCR中的温度应该如何设置呢?
...

这个要试,一般先以低的那个作参考,在其基础上降低1到2度,然后扩增,如果没有杂带就可以,如果有杂带就逐渐提高温度,直至没有杂带为止,如果温度调到扩增不出来,也还是没有合适温度就更换引物,主要是换酶切位点,或者保护碱基换成G或C

发自小木虫IOS客户端
不是优秀,而是不可替代
28楼2017-10-14 22:55:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

育种小飞

新虫 (初入文坛)

扩基因全长,分两种情况,如果是从质粒中扩,引物直接取起始密码子和终止密码子,如果从cDNA中扩,那就必须在utr区设计引物,

发自小木虫IOS客户端
29楼2017-10-15 15:09:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

didongwei

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
30楼: Originally posted by 林小露 at 2017-10-15 21:08:57
我的原模版是提取mRNA反转得到的CDNA,也可以用这个方法的是吗?
...

这个可以的……先以最低Tm为基础减1到2度试,有非特异扩增就继续加温度。

发自小木虫IOS客户端
不是优秀,而是不可替代
32楼2017-10-16 00:20:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

kentyu

金虫 (著名写手)

可以长一点,保证两条引物的TM值相差在5度以内

发自小木虫IOS客户端
2楼2017-10-12 17:26:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

林小露

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by kentyu at 2017-10-12 17:26:21
可以长一点,保证两条引物的TM值相差在5度以内

谢谢您的回复啊。本人是新手,这个一整段基因序列长度就是946bp,我是想扩增出来表达蛋白质的。请问如何长一点呢?不懂
3楼2017-10-12 20:04:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-10-13 07:49:10
如果已经有CDS。
为什么还需要引物呢?

直接P全长就好了。
及时行乐,人生不留遗憾!
4楼2017-10-12 20:49:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kentyu

金虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 林小露 at 2017-10-12 20:04:20
谢谢您的回复啊。本人是新手,这个一整段基因序列长度就是946bp,我是想扩增出来表达蛋白质的。请问如何长一点呢?不懂...

引物的长度呀,不是基因的长度

发自小木虫IOS客户端
5楼2017-10-12 22:18:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wareer

铜虫 (小有名气)

上下游直接取,只要Tm相近即可,不用管长度

发自小木虫Android客户端
6楼2017-10-12 22:39:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

didongwei

金虫 (正式写手)

你上游引物在1一20bp选?那基本上是没得选呀。你的实验目的是什么?

发自小木虫IOS客户端
不是优秀,而是不可替代
7楼2017-10-12 23:12:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

林小露

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-10-12 20:49:15
如果已经有CDS。
为什么还需要引物呢?

直接P全长就好了。

有了CDS就不用引物了吗?PCR不都要引物吗?我目的就是想要全长,求大神赐教

发自小木虫IOS客户端
8楼2017-10-13 09:28:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

林小露

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by kentyu at 2017-10-12 22:18:15
引物的长度呀,不是基因的长度
...

哦哦哦哦,21位开始就是起始密码子,我看到有些文章上面说要克隆全长引物就要设置在起始密码子前面,不太懂原理,求赐教

发自小木虫IOS客户端
9楼2017-10-13 09:30:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

林小露

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by didongwei at 2017-10-12 23:12:58
你上游引物在1一20bp选?那基本上是没得选呀。你的实验目的是什么?

我的目的是克隆一整段基因序列然后成功表达,求大神赐教

发自小木虫IOS客户端
10楼2017-10-13 09:31:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 林小露 的主题更新
不应助 确定回帖应助 (注意:应助才可能被奖励,但不允许灌水,必须填写15个字符以上)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 他终究驯服不了我 +13 liwei_chen 2018-07-18 20/1000 2018-07-20 19:35 by liwei_chen
[论文投稿] 为正在投稿的文章祈福第一波 +6 hcoohboy 2018-07-20 6/300 2018-07-20 19:35 by chenxiaoustb
[公派出国] 找个雅思大神男朋友,明年一起去北欧读博 +38 坚持888 2018-07-19 53/2650 2018-07-20 19:28 by ljn1987
[论文投稿] 投稿,审稿人拒绝审稿 +7 王丽萍2500 2018-07-20 7/350 2018-07-20 18:26 by shimin0520
[论文投稿] 投了两次被拒,不知道有啥比较好中的北大核心期刊 +4 Leona羸 2018-07-18 9/450 2018-07-20 11:56 by Leona羸
[基金申请] 明天地学口基金是先评面上嘛? +10 dandanrushui 2018-07-18 15/750 2018-07-20 07:08 by Stefanieee
[考研] 请问有中山大学化学工程专硕的小哥哥,小姐姐吗 +5 jdyjslyt 2018-07-14 9/450 2018-07-19 22:39 by 七彩色萝卜
[论文投稿] 发表快的期刊 +6 Vickychao 2018-07-18 8/400 2018-07-19 13:09 by 狂奔的木乃伊
[文学芳草园] 叶散的时候,明白欢聚;花谢的时候,明白青春。 +20 青栀_428 2018-07-17 45/2250 2018-07-19 00:25 by 海纳专一
[论文投稿] 请问,投稿springer旗下的一个期刊,被拒之后选择了同意transfer,请问多久会有消息? 5+3 ZHimages 2018-07-18 9/450 2018-07-18 23:15 by nono2009
[留学DIY] 雅思资料分享,需要者请私信 +4 orangered 2018-07-17 8/400 2018-07-18 20:14 by orangered
[基金申请] 当前自科基金执行到什么时候可以开始申请下一个 +5 hijudy 2018-07-17 7/350 2018-07-18 16:16 by ray43
[教师之家] 想念导师 +3 一问不知 2018-07-17 3/150 2018-07-18 12:27 by ziliy
[论文投稿] 返修稿 +7 luckydgd 2018-07-18 12/600 2018-07-18 12:07 by 501273225
[基金申请] 谁知道今年国家基金什么时候出会评结果 +9 zucker007 2018-07-18 10/500 2018-07-18 09:57 by guany2008
[高分子] 紫外线吸收剂这类产品怎么样? +7 LYKTZ1234 2018-07-14 20/1000 2018-07-16 15:15 by LYKTZ1234
[留学DIY] 新加坡国立大学工程类专业博士 +5 水波儿 2018-07-13 11/550 2018-07-16 12:10 by zhulei0324
[职场人生] 杜克大学博士后 代尔夫特大学博士后 南京航空航天大学讲师 +5 没来由 2018-07-15 8/400 2018-07-15 22:01 by 没来由
[基金申请] 信息青年评完了吗 +8 redeastfan 2018-07-14 12/600 2018-07-15 00:13 by sdlywang
[论文投稿] Nature子刊editor decision started,9天了 +3 yr1911128870 2018-07-13 6/300 2018-07-14 09:10 by qiqingkai009
信息提示
请填处理意见