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【调剂】北京石油化工学院2024年16个专业接受调剂
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临溪蜚蜚

新虫 (初入文坛)

[求助] 菌液PCRp不出来？！！！已有9人参与

最近在做构建质粒的实验。我是以cDNA为模板p全长为1kb的基因，用连接产物转化DH5a，板上长的单克隆并不多，且菌落比较小，挑单克隆摇菌后进行菌液PCR，之后鉴定没有出现条带，阳性对照也没有条带，请问这种情况会是什么原因呢？载体已经去磷了，引物也没有错。希望知道的朋友能给解答一下，感激不尽！
PCR体系如下：
                                      10ul
                 菌液                2
               10Xbuffer        1
                 taq                0.2
                 dNTPs           0.75
                 F                    0.25
                 R                   0.25
                 ddH2O         5.55
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1楼2017-08-21 20:38:19
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HAYDEN110

银虫 (小有名气)
程序，一开始的温度，时间要延长哦，十分钟左右，遇热裂解。其次，把菌收集后，用水洗一下，然后加去离子水稀释一下，用稀释的菌液p

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8楼2017-08-22 11:47:34
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yufeiwaner

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-09-02 22:28:43
兄弟，用20微体系比较好，还有，你用的是你目的片段的引物，还是质粒上的通用引物？通用引物P不出来，说明长的都是杂菌，P出来条带小，则说明载体自连接严重。目的片段引物P不出来，则杂菌和空载都有可能。2微菌液相对于10微体系太多了。
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14楼2017-08-30 11:23:21
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能量车gogogo

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-09-02 22:29:42
阳性对照都没有条带：
1，可能是感受态有问题，根本就没有转进去，我前段时间也出现过这种跑步出条带的问题，最后发现是买的感受态有问题。
2，可能从一开始就没有连接上，自然也就转化不进去。
3，我一般用20ul 体系做菌液pcr,模板1ul,2Xpremix buffer（已经含有各种dNTP,以及taq酶） 10ul,引物各0.4ul,最后用水补充体系。
4，要是以上都没有问题，但还是跑步出条带，就是引物与模板的结合效率太低，试着重新设计引物把。
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人不会永远十七岁，但永远有人十七岁
16楼2017-09-02 21:36:53
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zhouxfd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
临溪蜚蜚: 金币+2, ★有帮助 2017-08-22 11:20:25
用提出的质粒鉴定是否阳性跟具有可信度，PCR不work证明你的体系有问题，建议通过阳性对照找到问题原因，比如换一下其他的酶试试
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2楼2017-08-22 07:35:44
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
临溪蜚蜚: 金币+2, ★有帮助 2017-08-22 11:20:35
菌液最好不要超过0.5UL，里面的杂质会抑制PCR.但你2UL没P出来，也可能没连上。
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采菊东篱下，悠然见南山。
3楼2017-08-22 07:55:58
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ghst110

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
临溪蜚蜚: 金币+2, ★有帮助 2017-08-22 11:19:58
不知道楼主是什么抗性的质粒。如果感觉单菌落生长不正常，可能就不是你想要的转化子；
菌液PCR是比较好P出来的。但是10ul体系加2ul菌液实在太多了（原则上任何模板体积不应超过反应体系1/10），因为Reaction Buffer反应缓冲有限，而且菌液内存在抑制物可能会干扰实验结果。
建议：1，扩大PCR体系（20ul,最好50ul),降低菌液量（0.5-1）
          2,换一家更好性能的聚合酶产品试试。
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*才随遇长，识以穷精*
6楼2017-08-22 11:05:12
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ghst110

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-09-02 22:29:02
引用回帖:
7楼: Originally posted by 临溪蜚蜚 at 2017-08-22 11:19:42
好的，谢谢  我用的是卡那的抗性板，载体已经去磷了，我觉得自连的可能性很小，如果板上长的不是空载和重组质粒，那该是什么呢？...

你是用传统的酶切酶连来构建质粒，还是用Gibson Assembly/In Fusion?板上长出不是想要的菌落，不外两个原因：1.质粒残留：线性化载体不彻底；切胶回收残留。2污染，污染了外部细菌或者目的片段污染了小片段，这个小片段连进了载体。。。
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*才随遇长，识以穷精*
9楼2017-08-22 13:13:15
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HAYDEN110

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 临溪蜚蜚 at 2017-08-22 15:55:04
嗯嗯，程序是第一步95℃10min， 请问 “把菌收集后，用水洗一下”这个是怎么做？  我挑单克隆后是用20ul的LB+卡那摇的...

太少了，收集多一些菌液，比如，收集500ul，离心，去除培养液，再加个200ul去离子水适当浓缩一下，然后取1ul做菌液p，取多少p，就看你菌的浓度了

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12楼2017-08-22 16:49:38
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-09-02 22:29:25
多半是目的片段没连接上，可能的错误有很多，我遇到过几次问题是连接酶体系的缓冲液有问题。其实PCR这些多半不太会错的。大部分原因总结下来都是缓冲液PH值有问题，不知道虫友有没有遇到同样的怪圈
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15楼2017-08-30 14:17:18
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Isaac Li

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
17楼2017-09-05 11:48:47
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369443288

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

那就是可能假阳性咯，加点抗生素，蓝白斑筛选
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诞生之日
18楼2017-09-05 16:49:24
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普通回帖

临溪蜚蜚

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhouxfd at 2017-08-22 07:35:44
用提出的质粒鉴定是否阳性跟具有可信度，PCR不work证明你的体系有问题，建议通过阳性对照找到问题原因，比如换一下其他的酶试试

“用提出的质粒鉴定是否阳性跟具有可信度” 请问这句话怎么理解，我没有提质粒，通过阳性对照找问题该怎么做呢？
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4楼2017-08-22 09:01:33
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临溪蜚蜚

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 781055707 at 2017-08-22 07:55:58
菌液最好不要超过0.5UL，里面的杂质会抑制PCR.但你2UL没P出来，也可能没连上。

哦  我取菌液1ul的时候，还是一样的体系，一样的酶，单克隆没有条带，但是阳性对照也用1ul时有很浅的条带，为什么2ul就不出来呢？
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5楼2017-08-22 09:04:12
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临溪蜚蜚

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ghst110 at 2017-08-22 11:05:12
不知道楼主是什么抗性的质粒。如果感觉单菌落生长不正常，可能就不是你想要的转化子；
菌液PCR是比较好P出来的。但是10ul体系加2ul菌液实在太多了（原则上任何模板体积不应超过反应体系1/10），因为Reaction Buffe ...

好的，谢谢  我用的是卡那的抗性板，载体已经去磷了，我觉得自连的可能性很小，如果板上长的不是空载和重组质粒，那该是什么呢？
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7楼2017-08-22 11:19:42
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临溪蜚蜚

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by HAYDEN110 at 2017-08-22 11:47:34
程序，一开始的温度，时间要延长哦，十分钟左右，遇热裂解。其次，把菌收集后，用水洗一下，然后加去离子水稀释一下，用稀释的菌液p

嗯嗯，程序是第一步95℃10min， 请问 “把菌收集后，用水洗一下”这个是怎么做？  我挑单克隆后是用20ul的LB+卡那摇的
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10楼2017-08-22 15:55:04
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