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shipeng001银虫 (小有名气)
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[求助]
链霉菌与ET12567（pUZ8002）接合转移问题求助已有4人参与
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现在研三，一直在用ET12567（pUZ8002）做链霉菌的接合转移，研一研二做的好好的，整合型载体（如pJTU824，pSET152）能长满板，用fosmid做敲除也能长10个左右接合子；可就是后来怎么做都不成功，整合型载体都做不进去了，真是见鬼。。。想问问虫友们有没有类似的经历，或是有什么好的解决办法。 我们实验室使用TES热击后，加2*孢子萌发液，30 ℃预萌发的；我也试过用2*YT，可效果还是不理想。 (1)TES缓冲液：0.05M PH8.0 (2)2X孢子预萌发培养基：酵母膏，1%；酪蛋白氨基酸，1%；CaCl2,0.01M 1.带有oriT的目的质粒转化进入大肠杆菌ET12567( pUZ8002),得到转化子; 2. 将转化子的过夜培养物转接到5 mL含50 ug的Apr、卡那和氯霉素的LB中， 37 ℃，200 r/min培养转化子,到合适浓度(OD600:0.4-0.6)收集菌体; 3. 用等体积新鲜的LB洗涤菌体两次(洗掉抗生素), 1 mL的LB悬浮，备用; 4. 链霉菌孢子的热激和预萌发 (1)制备浓的孢子悬液 (2)新鲜孢子悬浮于2 ml 0.05 M PH8.0 的TES; (3)50oC水浴热激10分钟; (4)冷却到室温后加入等体积2X孢子预萌发培养基; (5)37oC摇床分别培养2-３小时; （6）离心收集孢子并重新悬浮于适量的水或TES中; （7）在振荡器上打散孢子 5. 按(1*e-8)：(1*e-9)与3中的大肠杆菌混匀 6. 30oC培养13-20小时左右用适当浓度的抗生素和萘啶酮酸（抑制大肠杆菌）覆盖 7. 30oC培养数天（一般2-3天）可得到接合转移子. 8. 挑选接合转移子PCR验证; 还请大家不吝赐教，感谢。  |
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kakashi冠
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