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shipeng001

银虫 (小有名气)

[求助] 链霉菌与ET12567(pUZ8002)接合转移问题求助已有1人参与

现在研三,一直在用ET12567(pUZ8002)做链霉菌的接合转移,研一研二做的好好的,整合型载体(如pJTU824,pSET152)能长满板,用fosmid做敲除也能长10个左右接合子;可就是后来怎么做都不成功,整合型载体都做不进去了,真是见鬼。。。想问问虫友们有没有类似的经历,或是有什么好的解决办法。
     我们实验室使用TES热击后,加2*孢子萌发液,30 ℃预萌发的;我也试过用2*YT,可效果还是不理想。
(1)TES缓冲液:0.05M  PH8.0
(2)2X孢子预萌发培养基:酵母膏,1%;酪蛋白氨基酸,1%;CaCl2,0.01M

1.带有oriT的目的质粒转化进入大肠杆菌ET12567( pUZ8002),得到转化子;
2. 将转化子的过夜培养物转接到5 mL含50 ug的Apr、卡那和氯霉素的LB中, 37 ℃,200 r/min培养转化子,到合适浓度(OD600:0.4-0.6)收集菌体;
3. 用等体积新鲜的LB洗涤菌体两次(洗掉抗生素), 1 mL的LB悬浮,备用;
4. 链霉菌孢子的热激和预萌发
(1)制备浓的孢子悬液
(2)新鲜孢子悬浮于2 ml  0.05 M PH8.0 的TES;
(3)50oC水浴热激10分钟;
(4)冷却到室温后加入等体积2X孢子预萌发培养基;
(5)37oC摇床分别培养2-3小时;
(6)离心收集孢子并重新悬浮于适量的水或TES中;
(7)在振荡器上打散孢子
5. 按(1*e-8):(1*e-9)与3中的大肠杆菌混匀
6.  30oC培养13-20小时左右用适当浓度的抗生素和萘啶酮酸(抑制大肠杆菌)覆盖
7.  30oC培养数天(一般2-3天)可得到接合转移子.
8. 挑选接合转移子PCR验证;

还请大家不吝赐教,感谢。
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菁酱

新虫 (初入文坛)

2楼2017-09-26 20:37:22
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菁酱

新虫 (初入文坛)

还有还有,请问第六步,用抗生素和萘啶酮酸覆盖这个操作是什么意思啊??先涂布混合菌液。等半天之后再涂药液吗?用不用涂布器把药液涂干吖??不可以直接做成含药平板吗?

发自小木虫Android客户端
3楼2017-09-26 20:49:05
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shipeng001

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 菁酱 at 2017-09-26 20:49:05
还有还有,请问第六步,用抗生素和萘啶酮酸覆盖这个操作是什么意思啊??先涂布混合菌液。等半天之后再涂药液吗?用不用涂布器把药液涂干吖??不可以直接做成含药平板吗?
...

你好,用含有抗生素和萘啶酮酸的1 mL无菌水覆盖,超净台内吹干后30 ℃培养。不可以直接涂含抗生素培养基。
4楼2017-12-27 17:11:03
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kakashi冠

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 菁酱 at 2017-09-26 20:49:05
还有还有,请问第六步,用抗生素和萘啶酮酸覆盖这个操作是什么意思啊??先涂布混合菌液。等半天之后再涂药液吗?用不用涂布器把药液涂干吖??不可以直接做成含药平板吗?
...

先让菌株复苏然后再铺药,一开始就铺药影响菌株生长,我是这么理解的。另外,能否赠送ET12567这个菌,马上做接合转移了实验室没有这个菌株,谢谢
5楼2018-01-03 11:50:18
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笔画小木虫

新虫 (初入文坛)

我现在遇到的问题和你一模一样,也是研三,突然重复不出来了,请问你是怎么解决的呀,真的很着急
6楼2018-05-16 16:46:52
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In_vain

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

1、第五步,我都是用28℃恢复培养的,为什么你这里用的是37℃呢?
2、你用的孢子是新鲜的孢子吗?因为我最近发现孢子放在-20冰箱一段时间做的接合转移长的接合子就很少,之前的孢子是放在-80的,做的就长的很多。
3、第八步,你的接合子直接进行了PCR验证?没有纯化接合子吗?如果有请问你是怎么纯化的呢?
7楼2018-06-11 11:13:44
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dhdiskdb

禁虫 (初入文坛)

本帖内容被屏蔽

8楼2018-10-18 09:03:04
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弑君体

新虫 (初入文坛)

想问您最后做出来了没?发现是什么问题,目前我实验也卡在这里了,希望能得到指导。
9楼2019-07-17 17:44:49
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shipeng001

银虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 弑君体 at 2019-07-17 17:44:49
想问您最后做出来了没?发现是什么问题,目前我实验也卡在这里了,希望能得到指导。

后来又可以了,但是效率不如以前,不知道什么原因。

发自小木虫IOS客户端
10楼2020-02-14 20:34:37
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