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【调剂】北京石油化工学院2024年16个专业接受调剂
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jianshuilan

铜虫 (初入文坛)

[求助] 链霉亲和素磁珠提取DNA已有2人参与

选用的是Bioi-Mag链霉亲和素磁珠300nm，文献中选择的是ThermoFisher Scientific已经和生物素连接好的磁珠，磁珠粒径不知，，根据文献介绍，用无核酸水（含20ng/ul tRNA）洗脱，条件限制最后选用水洗脱，nanodrop检测不到DNA，后面0.2M NaOH洗脱，30-80ng/uL不等，求问1，文献中洗脱水中加入tRNA的作用是什么；2，链霉亲和素磁珠与生物素的结合溶液需要有什么成分；3，各位万能的虫友共享一下手头上的亲和素磁珠提取DNA的实验操作经验。感激不尽
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1楼2017-04-14 10:29:09
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yhytz7007

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

A.        生物素标记蛋白抗体的固定
1.        颠倒混匀磁珠，吸取所需要量的磁珠（如25μl，0.5mg）加入1.5ml灭菌离心管中；
2.        加1ml蛋白结合/洗涤缓冲液，洗涤磁珠，磁场吸附，弃上清液；
3.        将磁珠重悬于1ml蛋白结合/洗涤缓冲液，加入100-200μl含生物素标记蛋白的样品，轻柔振荡，在室温下孵育15-60分钟；
4.        磁场吸附，弃去上清液；
5.        加入蛋白结合/洗涤缓冲液（每次1ml）洗涤磁珠3-5次，每次5min，磁场吸附，弃去上清液；
6.        将磁珠重悬在合适的缓冲液中，用于下游实验。
B.        生物素标记核酸的固定
1.        颠倒混匀磁珠，吸取所需要量的磁珠（如25μl，0.5mg）加入1.5ml灭菌离心管中；
2.        加1ml核酸结合/洗涤缓冲液，洗涤磁珠，磁场吸附，弃上清液；
3.        将磁珠重悬于500μl核酸结合/洗涤缓冲液，加入100-200μl含生物素标记分子的核酸样品中，轻柔振荡，在室温下孵育10-15分钟；
4.        磁场吸附，弃去上清液；
5.        加入500μl核酸结合/洗涤缓冲液洗涤磁珠3-5次，每次2min，磁场吸附，弃去上清液；
6.        将磁珠重悬在合适的缓冲液中，用于下游实验。
【固定生物素标记的RNA，请在核酸结合/洗涤液中加入RNase Inhibitor.】
C.        分离生物素标记分子
链霉亲和素-生物素相互结合的强度很高，只有在特定条件下才能把生物素标记的分子从磁珠上洗脱下来：
1.        标记蛋白的解离：将固定有蛋白分子的磁珠重悬于SDS-PAGE reducing sample buffer，煮沸5分钟，再用磁场分离，以获得含蛋白分子的上清液，可用于SDS-PAGE凝胶电泳等检测。
2.        标记核酸的解离：将固定有DNA的磁珠重悬于10mM EDTA (pH 8.2)，95% formamide，在65°C孵育5分钟或90°C孵育2分钟，以解离DNA。
3.        分离生物素与链霉亲和素的处理过程会使链霉亲和素蛋白变性，因此磁珠不能被重新使用。
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2楼2017-04-17 16:22:01
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jianshuilan

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yhytz7007 at 2017-04-17 16:22:01
A.        生物素标记蛋白抗体的固定
1.        颠倒混匀磁珠，吸取所需要量的磁珠（如25μl，0.5mg）加入1.5ml灭菌离心管中；
2.        加1ml蛋白结合/洗涤缓冲液，洗涤磁珠，磁场吸附，弃上清液；
3.        将磁珠重悬于1ml蛋白结合/洗涤 ...

谢谢您的回复。还有以下疑问：1.生物素标记的核酸样品是指目的核酸已经被生物素标记了吗？如果是生物素标记了探针，然后探针结合目的核酸的话，生物素标记的探针与核酸的结合条件，你是否有相关实验经验？2.您这里的磁珠与生物素之间的比例大概是多少？100-200μl含生物素标记分子的核酸样品的浓度是多少？感谢不吝赐教
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3楼2017-04-27 14:56:05
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shenshou167

新虫 (小有名气)
你这个也太奢侈了，提取DNA用链霉亲和素磁珠，我们家专门做磁珠的，用硅基磁珠就可以。当然用SA磁珠也可以QQ625006192

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4楼2017-04-27 18:24:54
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Betreace16

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yhytz7007 at 2017-04-17 16:22:01
A.        生物素标记蛋白抗体的固定
1.        颠倒混匀磁珠，吸取所需要量的磁珠（如25μl，0.5mg）加入1.5ml灭菌离心管中；
2.        加1ml蛋白结合/洗涤缓冲液，洗涤磁珠，磁场吸附，弃上清液；
3.        将磁珠重悬于1ml蛋白结合/洗涤 ...

想问一下您用的磁珠粒径大概在什么范围，感谢
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5楼2017-05-10 09:36:50
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Betreace16

新虫 (初入文坛)
请问能把你提到的文献给看一下吗，感谢
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6楼2017-05-10 09:53:26
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yubeihong

铁杆木虫 (职业作家)
表述不清楚，链霉亲和素肯定是和生物素修饰的东西特异结合，否则没必要用这种磁珠

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7楼2017-05-14 22:18:45
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zyzy3692

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我用的SA磁珠，然后用生物素修饰了DNA，SA与生物素在PBSK缓冲液中就结合上了，很好结合的啊
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8楼2017-06-06 14:23:18
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zceqnp33
9楼2017-08-18 01:43:11
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cugpf957
10楼2017-08-18 12:00:40
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