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无人的舞台

新虫 (初入文坛)

[交流] 胶回收

请问各位大神,小弟初做分子实验,做胶回收总是收不回来,怎么回事呢?而且PCR跑胶不太亮

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泊然菊魂

新虫 (初入文坛)

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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-03-07 07:29:02
一可能PCR产物少;二是可以配一个浓度稍低一点的胶,如果割的胶太多的话也会有点浪费DNA;二柱子活化不充分,或者后面溶解的时候DNA太干了,没有完全从膜上溶下来。四、仅供参考,我也只是做过那么一两次胶回收。

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2楼2017-03-06 20:33:25
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drwhoknowss

铜虫 (小有名气)


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用pcr产物做模版,再Pcr一次

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healthy
4楼2017-03-06 21:41:10
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笨笨的云

新虫 (初入文坛)

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-03-07 07:29:24
你这种情况应该是PCR产物浓度太低了,以前我也有这种情况,条带不亮都不敢回收,因为本来纯化就要损失一部分的,浓度太低就先不要回收。
活到老学到老
3楼2017-03-06 20:57:42
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泊然菊魂

新虫 (初入文坛)

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-03-07 07:30:09
PCR产物太少的话,浓度低点儿的胶也是不可以的。我记得当时是0.8%的胶,胶层不要太厚,这样割下来的胶含的琼脂糖少点,回收时DNA的损失会少一点儿。我也只是曾经做毕设的时候做过两次,希望不要误导你。

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7楼2017-03-06 23:24:55
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旷野の风

金虫 (小有名气)

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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-03-07 07:30:24
1、用50ul的体系进行PCR ,一次做两管;2、做胶用大孔梳子,相邻两个点样孔分别加50ulPCR产物;3、胶回收最后一步加20ul水溶解DNA。这样胶回收的浓度一半在40ng/ul左右

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8楼2017-03-06 23:42:01
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绝对零度的笑

木虫 (正式写手)


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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-03-07 07:30:51
配50ul反应体系,分成4管来做PCR反应,产率会比单独一管50ul的要高很多
9楼2017-03-07 01:51:43
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drwhoknowss

铜虫 (小有名气)

用pcr产物做模版,再Pcr一次

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healthy
5楼2017-03-06 21:41:23
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林夕boss

新虫 (初入文坛)


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引用回帖:
2楼: Originally posted by 泊然菊魂 at 2017-03-06 20:33:25
一可能PCR产物少;二是可以配一个浓度稍低一点的胶,如果割的胶太多的话也会有点浪费DNA;二柱子活化不充分,或者后面溶解的时候DNA太干了,没有完全从膜上溶下来。四、仅供参考,我也只是做过那么一两次胶回收。
...

请问为什么浓度低的胶可以达到效果?

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6楼2017-03-06 23:10:39
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bbass533

银虫 (小有名气)



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PCR产物不亮,肯定回收效率差。胶回收至少损失5成,楼上有人说低浓度胶回收好,这个确实,什么原因我不知道,我只知道之前无聊我对比过,确实是低浓度胶回收效果更好点。
首先你把PCR产物量提上去,后续的根据说明书来,一般是没问题的。
10楼2017-03-07 13:44:06
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