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陈彪

木虫 (小有名气)

科研狗

[交流] 蛋白上的点击(click)反应,用ABPP的方法寻找靶标

大家好,我的研究方向是用activity-based protein profiling (ABPP)的方法寻找靶标。我最近做生物体系(蛋白体系)中的点击反应,最后跑完胶后发现没有条带,怀疑是click反应没有发生,理论上来说,我的探针与蛋白作用后如果click发生了,那么蛋白就标记上了biotin经亲和素磁珠纯化后应该是有蛋白在磁珠上的,那么再用loading buffer煮沸后再跑胶应该是有条带的,可是却什么都没有。请大神帮我分析分析原因,靠这玩意毕业,感激不尽!希望有这个领域的朋友可以指导下我的实验!具体实验操作如下:
1.将细胞破碎提取总蛋白(超声法)
2.用探针处理总蛋白(探针上有炔基),25℃下震荡3h。(蛋白几乎都沉淀了,这个情况正常吗,之前用其他的药在相同条件下都没有蛋白沉淀)
3.然后加入click试剂,biotin-N3浓度为100微摩尔,TCEP浓度为1毫摩尔,配体TBTA为100微摩尔,最后加入硫酸铜浓度为1毫摩尔,25℃下震荡3h
4.加入5倍体积的冷丙酮沉淀蛋白,离心后用0.2SDS/PBS溶解蛋白,然后加入链霉亲和素磁珠混合1h
5.然后洗涤磁珠,洗完后用loading buffer煮沸将蛋白从磁珠上洗脱下来,然后SDS-PAGE,发现一条带都没有。
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陈彪

木虫 (小有名气)

科研狗


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-10 07:25:15
都没有人回答一下啊
2楼2016-06-24 22:07:42
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霓雨星灵

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by 陈彪 at 2017-07-11 17:03:19
谢谢。是因为结合太弱了。问题已解决。...

请问怎样解决的呢?
17楼2019-03-18 11:10:47
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普通回帖

goyohen

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
大侠,请问你这个问题解决了嘛?我也遇到类似的问题

发自小木虫IOS客户端
3楼2016-08-09 12:45:32
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aishangcaise

新虫 (初入文坛)

★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
陈彪: 金币+1 2016-11-30 12:57:16
陈彪: 金币+4, 谢谢 问题已解决 2017-03-08 19:49:50
我最近在看相关的文献,但是没有做过这个实验,这里提一下我的想法,就是你现在考察的药物他与目标蛋白的相互作用机理是啥样的,会不会是探针与蛋白质结合太弱了,然后蛋白结合不稳定,所以最后提不出来蛋白质?只是个人外行看法。如果是错误的,也请你回头帮我解释下,定方向中。
4楼2016-09-22 09:40:14
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mxy19920412

铁虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
请问你破细胞的时候超声条件是啥啊,最近也在做破细胞收集蛋白的实验,新手一个,请教一下~感激不尽~
5楼2016-09-23 16:02:30
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陈彪

木虫 (小有名气)

科研狗

引用回帖:
5楼: Originally posted by mxy19920412 at 2016-09-23 16:02:30
请问你破细胞的时候超声条件是啥啊,最近也在做破细胞收集蛋白的实验,新手一个,请教一下~感激不尽~

超声破碎
6楼2017-04-06 13:40:37
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18234084753

新虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
1楼: Originally posted by 陈彪 at 2016-06-23 17:31:53
大家好,我的研究方向是用activity-based protein profiling (ABPP)的方法寻找靶标。我最近做生物体系(蛋白体系)中的点击反应,最后跑完胶后发现没有条带,怀疑是click反应没有发生,理论上来说,我的探针与蛋白 ...

我也是这个方向

发自小木虫Android客户端
7楼2017-05-12 00:36:42
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18234084753

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by 18234084753 at 2017-05-12 00:36:42
我也是这个方向
...

请教一下您的点击反应条件,注意事项,我用DMSO做溶剂,溴化亚铜抗坏血酸,可是质谱没有我需要的峰

发自小木虫Android客户端
8楼2017-05-12 00:38:46
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陈彪

木虫 (小有名气)

科研狗

引用回帖:
4楼: Originally posted by aishangcaise at 2016-09-22 09:40:14
我最近在看相关的文献,但是没有做过这个实验,这里提一下我的想法,就是你现在考察的药物他与目标蛋白的相互作用机理是啥样的,会不会是探针与蛋白质结合太弱了,然后蛋白结合不稳定,所以最后提不出来蛋白质?只是 ...

谢谢。是因为结合太弱了。问题已解决。
9楼2017-07-11 17:03:19
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陈彪

木虫 (小有名气)

科研狗

引用回帖:
7楼: Originally posted by 18234084753 at 2017-05-12 00:36:42
我也是这个方向
...

请问您是哪个高校的?现在做的怎么样?

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10楼2017-08-15 11:01:22
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