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[交流]
请教一个关于目的基因与PMD19T载体连接转化的问题已有19人参与
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我的目的片段长度815bp左右，采用自己设计的加BamH I 、Sal I 酶切位点的引物扩增，PCR使用TAKARA公司的Ex-Taq酶（扩增后带有A尾），pcr产物凝胶回收后再与PMD19T载体（2692bp）连接，转化至DH5α大肠感受态细胞，涂布到Amp平板，蓝白斑筛选挑取白色菌落摇菌。再以PMD19T载体的通用引物M13-47、RV-M进行菌落PCR鉴定（吸取摇菌菌液1μl作为底物），没有出现目的条带，在3000bp左右出现较淡的单一条带，想请教下大家为什么会出现这种情况，万分感谢！ 如下图1所示，泳道1为100bp marker，泳道2-5为目的基因回收片段电泳，此次构建我选择了泳道3产物。图2中泳道1-10,12-16均为菌落PCR产物，泳道17为阴性对照，泳道11为100bp marker，泳道18为250bp marker，图中红色标注I为3000bp左右条带，图中红色标注II不知是否为引物二聚体（疑惑点在于有些样本有，有些样本无图中II标记的条带）  图1.jpg  图2.png |
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9楼2016-04-21 14:36:49
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你的片段不大。一般19-T很容易连上的。如果做了多次还不成功，建议优化连接体系。多设置几个摩尔比。如果片段本身结构较特殊。还可以对回收产物进行65度5min立即冰浴2min的预处理。有助于打开片段本身二级结构。预处理完的片段再加solutionI和载体。还有就是如果EX扩增完条带很特异，建议直接过柱回收不要切胶回收。还可以试着直接加T4连接酶和buffer，以代替solutionI。如果还不行，换一下别的公司的载体。不过我一般1000bp以下的普通片段连18-T都没太大问题。（0.5-0.8微载体，4.5-5微片段，5微solutionI，16度过夜连）。祝顺利！ 发自小木虫IOS客户端 |
16楼2016-04-23 00:20:57
shanyoufeng
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我用的TAKARA的pmd19-T，说明书是写的连接时间很短，但我用的6个小时，目的基因750bp，效果非常好，一点问题没有。还有几次，因为有事，放pcr仪里15小时，也一样做出来了。但从来没小于6小时。延伸时间我都是用的10分钟。我建议你先把链接时间加长试试，应该就做出来了，祝好！ 发自小木虫Android客户端 |
33楼2016-04-23 13:29:30
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sandycool
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8楼2016-04-21 13:12:24
这个是不是就是没有连接上？10楼2016-04-21 21:36:18
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