24小时热门版块排行榜     先丰纳米 买纳米材料就点这里

热门推荐

查看: 1350  |  回复: 27

wy19871124

木虫 (著名写手)

质谱首席顾问


[交流] 质谱的N多东西已有25人参与

MS - 质谱入门
  了解质谱

  本入门指南覆盖了现代质谱实践相关的大部分主题,并解答了质谱使用和性能方面的一些常见问题。文中还提供了便于深入学习相关文章的链接。第一部门内容讨论谁使用质谱仪的问题,接着讲述化合物在离子源怎样被电离,以便于质谱仪分析。然后通过对质量准确性和分辨率等重要主题的讨论,或我们怎样区分紧密相关化合物之间的差别,来讲述各种类型的质谱仪。本指南涉及化学、样品制备和数据处理,以及当今最流行的MS应用中一些专业用语的定义。

  谁要使用质谱?

  在考虑使用质谱仪(MS)之前,应当考虑您分析工作的类型、您预期获得的结果等:

  - 您分析的是像蛋白质、肽等大分子,还是获取水溶性小分子的数据?

  - 您在确定的水平寻找目标化合物,还是表征未知样品?

  - 针对复杂基质,您当前的分离技术抗干扰能力强吗,或者您必须开发新的方法?

  - 您要求单位质量精度(比如400 MW),或5 ppm的质量精度(比如,400.0125 MW或质量为400时准确度为2 mDa)?

  - 您必须每天处理几百个样品?上千个样品?上万个样品?Who Uses MS?

1.jpg

图1:表征被测物特征的能力随质谱性能的增加而增强。

  化学、生物化学和物理学领域的各学科和分支学科的研究人员和专业技术人员通常会用到质谱分析。医药工业领域的工作人员在进行药物发现和药物开发时需要利用MS的特异性、动态范围及其灵敏度,区分复杂基质中紧密相关的代谢物,从而鉴定并量化代谢物。尤其是在药物的开发过程中,药物需要进行鉴定、纯化,确定早期的药代动力学,MS已经证实是不可或缺的工具。生物化学家扩展了MS的使用领域,将其应用到蛋白、肽和寡核苷酸的分析中。使用质谱仪,生物化学家们能够监测酶的反应,确定氨基酸序列,并通过包含有蛋白裂解片段衍生物样品数据库鉴别大分子蛋白。生物化学家通过氢-氘交换在生理条件下形成重要的蛋白-配体的复合物,监测蛋白质的折叠。临床化学家在药物检测和新生儿筛查中也应用MS,取代结果不确定的免疫分析。食品安全和环境研究人员也是这样。他们跟行业中相关的企业工作人员一样,也使用MS,比如:PAH和PCB分析,水质量分析,及食品农药残留分析。确定油组成是一项复杂且昂贵的工作,这刺激了早期质谱仪的发展,并不断推动该技术的继续创新。现今,MS的专业人员可以在各种质谱仪、一系列完善可靠的电离技术中进行选择。

  什么是质谱?质谱是怎样工作的?

  质谱仪可以比一枚硬币小,也可以装满非常大的房间。虽然不同仪器类型有不同的应用,但是其工作原理相同。测量单位为道尔顿(Da),代替其它单位,比如原子质量单位(amu)。1Da=单个碳12(12C)同位素原子质量的1/12。以前认为质谱仪不具定量能力,仅能作为定性设备,辅助化合物的鉴定。但现今,已经证实质谱兼具定性和定量功能。只有分子转化为气相离子后,质谱仪才能测量其质量。为了达到这一目的,质谱仪使分子带上电荷,然后将带电离子流转化为数据系统能够识别的成比例电流。数据系统将这一电流转化为数字信息,得到质谱图。

2.jpg

  图 2:a)像色谱图形一样,当总离子电流随时间改变时,总离子电流(TIC)的丰度增加。b)每个峰的数字部分表示此刻的离子,其构成了离子电流,离子电流通常被称为轮廓图或连续采集。X或‘时间'轴为质荷比(m/z),在图谱中(比如同位素)能读出相邻离子的分辨率。c)轮廓图谱通常缩减为‘棒状图,从每个峰的顶点降低质心,形成棒状图,从而减小存放文件的大小,有利于增加分辨信息。对目标分析物,有很多适合的方式,使其电离成离子:

  1) 在平面上,激光激发溶解在基质中的化合物,比如基质辅助激光解吸离子化(MALDI)法。

  2) 通过与带有能量的离子或电子的相互作用,比如电子轰击离子化(EI)。

  3) 自身输送过程的一部分,像我们已熟知的电喷雾电离(ESI),在此种电离中,从液相色谱流出的洗脱液经高电压作用,从气溶胶中形成离子。

  例子按照其质荷比(m/z),进行分离、检测而得到测量。将相对离子流(信号)与m/z制图,得到质谱图。小分子通常仅带单一电荷:因此m/z是质量与1的比值。"1"表示在离子化过程中增加了一个质子(表示为M+H+,或如果丢失一个质子表示为M-H-),或如果丢失一个电子形成离子,被称为自由基正离子(M+)。质谱仪的准确性,或质谱仪怎样测量实际真实的质量,可在本入门指南的后续章节中看到。较大分子自身结构的多个位点可捕获电荷。小肽通常能带2个电荷(M+2H+),而非常大的分子具有多个位点,可使用简单的算法,推断谱图中表示的离子质量。

3.jpg



  图 3:当准确校正后,低分辨率的质谱仪也可以得到非常准确的质量,但是因为较多的数据挤占了有限的分辨空间,因此不能提供更多的谱图信息。常见的含有9个氨基酸的Bradykinin多肽的代谢片段(BK1-5或Arg-Pro-Pro-Gly-Phe),ACE(血管紧缩素转化酶)用于扩张血管的抑制剂,可携带2个电荷(单个电荷或M+H的单同位素值为573.3149,而双电荷峰,或M+2H为287.1614)。戴带双电荷的同位素峰,也会挤占有效的分辨空间。

  能够分析的分子有多大?

  解吸电离(如在第22页所述)扩展了分析的能力,可分析分子量大、非挥发性、易碎的分子。对分子量40,000Da的常规检测,其准确度可达0.01%,(即质量偏差在4Da)允许过程中发生较小变化的测定,比如蛋白质的翻译后修饰。可带多个电荷扩展了质谱仪的测量范围,可以超越其设计的上限,可检测1000000Da或更大的质量。

  同位素和元素的质谱仪

  天然同位素丰度已清楚的表征。虽然通常认为丰度比较稳定,但是同位素丰度可能出现显著的特征性改变。在代谢研究中,应用同位素比例测定(同位素丰富的元素作为示踪剂),在气候研究中,测量温度依赖性氧和碳的变化。在实际中,使用高准确性的质谱仪,测量前,将复杂分子转化为简单分子化合物,这样转化后的化合物能通过扇形磁质谱仪检测。元素分析通常针对无机材料,确定元素组成,而不是结构,在一些情况下,可分析固体金属样品。常见于诱导偶合等离子体(ICP)源,放电器(或较低能量的发光放电)电离样品。在万亿分之一(ppt)水平使用专用仪器检测较为常见。

  常见的电离方法

  电子离子化[EI]

  电子电离(EI)为很多人所熟知。(在较早的时候称为"电子撞击",但是从技术上来说不准确。)EI,通常将样品暴露在70eV的电子下,被称为"硬"技术。电子与目标分子互作用的能量,通常要比分子的化学键要强的多,因此分子发生电离。过量的能量按照特定方式打开化学键。结果产生能够预见的、可鉴别的碎片,通过这些碎片,我们能够推测出分子结构。这些能量可将单个电子激发,从分子外层逸出,形成正离子自由基,得到丰富的碎片波谱。不同于"较软"的大气压电离技术,波谱响应会受到离子源设计特征的影响,EI技术完全独立于离子源的设计。同一化合物在一台EI质谱仪产生的图谱与另一台EI质谱仪得到的图谱非常相似,基于这一原理,可建立图谱库,将未知化合物的谱图与参照谱图比较。

  化学电离[CI]

  分子过度裂解的称为"软"技术。化学电离(CI)通过一较温和的质子转移过程生成离子,有利于分子离子的生成。将样品暴露到大量的溶剂气体,如甲烷形成质子化的分子离子(M+H)。反向过程将形成负离子。在一些情况下,质子被转移到气体分子上,形成负离子(M-H)。采用EI分析时,碎片丰富的化合物,有时可采用CI分析,以增加分子离子的丰度。类似于EI,样品必须具有热稳定性,因为在离子源里,被测物需要加热气化。对起始电离步骤,CI的电离机理依赖于EI,但是在离子源里是有高压化学反应气体,比如甲烷、异丁烷或氨。比被测物(R)的浓度高很多反应气体通过电子电离作用,发生电离,起初产生R+t,溶剂离子。R+离子与中性R分子发生碰撞,形成稳定的次级离子,其具有反应性,然后通过离子分子反应,使被分析物分子(A)离子化.

  负离子化学电离[NCI]

  对含捕获电子基团(例如,氟原子或硝基苄基)的被测物,能形成负离子化学电离(NCI)。比EI的灵敏度提高了很多倍(据报道,在某种情况下可提高100到1000倍以上)。NCI广泛应用于各种小分子,这些小分子通过或能够被化学修饰,促进电子捕获。在负离子中,有两类主要的负离子形成机制:电子捕获和反应物离子化学离子化。在CI条件下,电负分子能够捕获热电子,产生负离子。实际上的负离子化学电离,通过被测化合物(AH)与带负电的反应离子(R-或R-)之间反应引起电离。可能存在几类离子分子反应的类型,最常见的是脱质子反应。

  气相色谱[GC]

  可能对很多人来说,第一次接触质谱是将其作为气相色谱的检测器。GC/MS联用仪类型的范围已大大扩展,超越早期仪器设计的范围,在使用中满足日渐严格的法规要求,像环境分析、食品安全筛查、代谢组学,以及包括法医学、毒理学和药物筛查的临床应用。在过去,两种类型的质谱主导着GC/MS分析:扇形磁场和单四极杆质谱仪。对于前者,可提供高分辨率和准确的质量分析,用于有极高灵敏度要求的分析中。后者适

  合目标化合物的常规分析。

  [ 液相色谱 ]

  扇形磁场质谱仪,具有最具挑战的GC/MS分析能力:环境或工业样品中的二英,或竞技比赛中非法使用兴奋剂的筛查。在扇形质谱仪上能够以飞克(fg)检测水平进行高分辨率或选择性的分析。四极杆GC/MS系统推出不久,在目标分析应用中就已取得认可。美国环境保护局(USEPA)要求对大量环境污染物样品采用四极杆GC/MS质谱仪分析。因为这些分析应用的检测级别仅在皮克到纳克之间,相对于扇形磁场来说,四级杆磁场的灵敏度较低,但四极杆并没因此受到限制,相反,采用四级杆可大大降低成本,方便使用,并且便于携带。

  液相色谱[LC]

  这是一项革命性的技术,为大约80%不能采用GC分析的化学物质提供了分析途径,在近几十年来促进了质谱技术的显著提高。少数几个模型被挑出来(参见质谱‘简史'章节中的内容),开始实现MS与LC联用。可以说LCMS联用开始于1970年代,在1990年代早期,我们今天所熟知的LCMS技术成熟起来。很多现在我们使用的装置和技术都直接来自那个时候。在1900年代早期,俄国植物学家Mikhail S.Tswett定义了液相色谱技术。他的研究工作主要是分离从植物萃取的叶色素,在他的研究中,他用溶剂冲洗装填微粒的柱子。这是液相色谱最简单的形式,被测物溶解的溶液(流动相或浓缩相)与溶液流过的装填颗粒的床体(固定相)之间存在竞争作用,液相色谱就是依靠这种可预测、不断再现且具有很高精确性的相互作用实现分离。近年来,在色谱柱中装填各种功能性组分,以及能够准确传送流动相的溶剂输送系统的发展,使得LC成为很多分析行业的支柱。首字母缩略词HPLC是由Csaba Horváth在1970年提出,表明对液相色谱填充柱需要施加高压,以引起液体流动。从那以后,液相色谱的效能不断提高,较小颗粒的填料和较高的选择性上都取得了发展,将首字母缩略词改为高效液相色谱。

  [ 电喷雾电离 ]

  在2004年,色谱仪和柱技术得到进一步的发展,提高了液相色谱的分离度、分离速度和灵敏度。使用较小颗粒填料的色谱柱(1.7微米)、以15000psi(1000巴)的压力输送流动相的特殊设计色谱仪被称为超高效液相色谱(UPLC®技术)。在1970年代,John Knox等研究人员已经预测了UPLC所包含的很多技术特征。Knox预测最佳颗粒直径是1-2μm,并且色谱对摩擦热热灵敏。在UPLC技术开发过程中,必须解决如

  何制作抗干扰、均一的小颗粒填料的技术。

  电喷雾电离[ESI]

  "大气压电离"(API)的最重要的技术是ESI,ESI为各相关技术提供了基础,这些相关技术能在大气压,而不是在真空(托)下形成离子。样品溶解在极性溶剂中(一般比GC上使用的溶剂更难挥发),然后泵入不锈钢毛细管,不锈钢上施加2000到4000V的电压。当液体在大气压下,从毛细管流出时,液体被雾化,被雾化的液滴进一步去溶剂,释放出离子进入质谱仪。在静电吸引和真空联合效应下,诱导电离生成这些气态离子。

4.jpg

  图 4:位于前端的ESI探针简易图,与MS离子入口垂直。当溶剂进入分析器的稀薄真空区域时,锥体或逆流气通常辅助液滴去溶剂化。

  电势从液体转移到被分析物从而形成离子的机制仍然是个争论的主题。在1968年,Malcolm Dole提出电荷残留机制,在该机制中,他假定当液滴挥发时,液滴的电荷仍保持不变。液滴表面张力最终不能平衡电荷斥力,将小液滴炸裂成很多更小的液滴。持续发生这样的库仑力爆破,直到小液滴只含单一的被测物离子。当溶剂从最后形成的小液滴中挥发掉,即形成气态离子。在1976年,Iribarne和T homson提出了一个不同的模型,即离子挥发机制,在该机制中,通过库仑裂解形成小液滴,这类似于Dole模型的形成方式。但是,按照离子挥发理论,在液滴表面的电场强度相当高,使溶剂化离子逸出液滴表面,并直接将其转移进入气相,形成气态离子。实际上,这两种机制可能协同起作用:对于大于3000Da的物质,电荷残留机制起主导作用,而对于较低质量的分子,离子挥发机制起主导作用(参见R.Cole,"关于电喷雾电离质谱的一些原则",质谱杂志,35,763-772[2000])。

  液相色谱的流出物,以电荷平衡状态进入ESI探针。因此当溶剂离开ESI探针,溶剂需携带有净电荷。为了确保ESI具有连续性,必须通过电化学反应给溶液充电,将电子转移到电极表面。在其它的效应中,该过程可能引起溶液pH值的变化。据推测,在阳离子模式时,带正电液滴离开喷雾器,电极(氧化作用)必定要吸收电子。(在阴离子模式下,则相反。)电活性电极的表面面积、电流大小和化学品种类及其电极电势的特性都将产生影应。

  总的来说,ESI是一高效过程。不过,反应的活化量和能量差异对不同的物种是不同的。溶液流速和使用的电流对每个液滴形成也有限制。分子间的竞争以及目标被测物抑制效应也较为常见。

5.jpg

  图 5:离子形成之后,离子被"拖"过电势梯度(电场),到达计数板。

  扩展ESI的基本理论,比如将液体的体积极端的减小,例如在纳喷雾时,液体体积流速减少到30nL/min,这已经证实可提高效率,尤其在蛋白质和氨基酸这种样品非

  常宝贵、稀少的研究中。

  大气压化学电离[APCI]

  虽然大气压化学电离(APCI)技术与ESI同时发布,但是在1985年Fenn的研究成果发布,ESI很快商业化,而直到此时,APCI也没有广泛被采用。在1973年,Horning首次提出APCI,采用包括HPLC在内的各种导入技术,分析挥发性组分。APCI的附加功能是,将ESI难以转化为气相离子的被测物,即那些极性很小且易挥发的被测物经浓缩相(或液体)导入质谱仪。不同于ESI,APCI通过在热的气流中蒸发引导液,将中性被测物转化为气相。化学电离依赖于电荷在反应离子和目标分子之间的转移,产生可被分析的目标离子。大多数情况下,以阳离子模式在目标分子与小的H+离子之间形成加合物,虽然与盐的加合物也比较常见。

  生物分子电离方法

  用于生物大分子鉴定的电离技术已经成熟,这类技术电离方式比较温和,不会将生物分子打碎。在生物分子分析和蛋白组学中公认有两个"能量沉积"过程,分别是电子捕获解离(ECD)2和电子转移解离(ETD)3。两种电离法都可以断裂邻近电子捕获位点的化学家键,不同于其它裂解过程,比如碰撞诱导解离(CID),断裂的键在分子内不是最不稳定的。实测的断裂对肽序列的依赖性较低,因此在肽骨架中,大多数氨基酸之间的断裂往往不依赖于分子大小。在肽的ECD和ETD中,最主导的裂解形成c和z离子。ECD已证实,对不稳定的翻译后修饰分析有效,比如磷酸化作用和O-糖基化,以及完整蛋白的裂解分析。当结合酰胺氢/氘交换分析时,已表明ESI质谱法能进一步辅助阐明溶液中蛋白的结构细节。使用较少量样品,由电荷状况分布和ESI在蛋白质上形成的一系列多电荷离子,可以得到较大蛋白的溶液组成信息,而通过其它技术,比如紫外圆二色光谱(CD)和色氨酸荧光不容易实现(但是通常将这些和其它相关技术,比如核磁共振,联合使用)。其它技术只能测定溶液大量蛋白的平均属性,而采用MS的另外一个好处是能提供瞬间或折叠中间体的结构细节。

  其他电离方式

  纯净化合物可置于进样棒或固体探针的顶端,导入离子源。随着加热,样品升华或蒸发,进入气相。在大多数情况下,按此法接着发生电离。但是在一些情况下,电离与升华或蒸发同时发生。

  大气压光电离(APPI)

  - 被测物直接或掺杂剂辅助光量子电离,电离电势低于10eV(主要由氪气灯的光量子能量输出)。LC通常使用的溶剂电离电势大于10eV。在实验室中,APPI是主要的API替代方法之一,因为APPI扩展了非极性被测物的电离范围,可以电离那些ESI和APCI有效电离的化合物。

  基质辅助激光解吸(MALDI)

  - 是一种软电离技术,用于完整蛋白、肽和大多数其它生物分子(寡核苷酸、碳水化合物、天然产物和脂),以及异质样品的分析(复杂生物样品的分析,比如蛋白水解消化物)。

  - 高能的光量子与混入有机基质的样品之间的相互作用,通常具有低于皮克摩尔的灵敏度。

  - 在1988年,由Tanaka,Karas和Hillenkamp第一次推出的技术。

  快原子轰击(FAB)

  - 软电离的早期方式,使用铯离子流,从溶解在甘油或类似基质的样品喷射出离子。解吸附

  - 等离子体解吸附(PD):核裂解片段与沉积在金属箔上的固体样品的相互作用。

  - 次级离子MS(SIMS):高速离子撞击沉积在金属板上薄层样品,或包含在液体基质的薄层样品(液体SIMS)。

  - 场解吸:对沉积在支撑物上的样品,施加高梯度场。

  - 解吸附电喷雾电离(DESI):像实时直接分析(DART )、大气压固体分析探针(ASAP)等紧密相关的技术,以及其它近来进入市场的技术,这些技术往往通过在一个表面的二次相互作用得到离子。在DESI中,带能液体流对准沉积在平面上的样品,在大气压下引起二次电离。

  使用什么类型的仪器?

  在质谱分析中,对实验控制力是尤其重要的。一旦在周密的控制条件下得到离子,必须以适合的灵敏度将每个离子作为离散事件实施检测。极少量的气体载量使GC成为联用技术早期理想的选择,但仅仅适合20%的化合物分析。现今,我们在大多数情况下雾化LC洗脱液,将其作为质谱仪中导入被测物实施电离的方法,该技术要求确保真空环境。

  任何质谱仪的一个重要设计元素是泵的容量。真空必须完全分布到仪器的所有稀薄大气区域,并且泵容量必须充足,以满足设计上的要求,比如离子入口的大小和需要去除蒸汽的量。

  分析器:质谱仪的心脏

  分析器是分离或区分导入离子的仪器。在离子源可以形成正负离子,以及不带电的中性粒子。但是,在指定时刻仅能记录一种极性。现代的质谱仪能够在毫秒间转换极性,得到高保真记录,即使快速短暂事件,如典型的UPLC或GC分离中,峰仅仅大约1秒宽。

  四级杆和扇形磁场

  在1953年,西德物理科学家Wolfgang Paul和Helmut Steinwedel描述了四级杆质谱仪。在4根平行杆之间,叠加的射频(RF)和恒定的直流(DC)电势能够作为质谱分离器,或过滤器,仅限于特点质量范围的离子,以恒定振幅振荡,能够在分析器上收集。现代仪器制造商将四级杆瞄准到特定的应用中。单四级杆质谱仪要求基质干净,以避免无用离子的干扰,表现出非常好的灵敏度。

  三重四级杆,或串联四级杆(参见四级杆),是将一个四级杆加到另一个附加的四级杆上,四级杆串联后能以各种方式发挥作用。一种途径是通过离子独有的质荷比(m/z)分离并检测复杂混合物中的目标离子。证实串联四级杆有效的另一途径是当与可控裂解分析联用时。这些分析通常将目标离子与其它分子(典型的气体,如氩)进行碰撞,母离子裂解成产物离子,MS/MS质谱仪通过其独特组成部分鉴别目标化合物。

6.jpg

  图 6:当设置过滤某一特定离子,那么其它质量的离子则会以多种方式中丢失,比如撞击到四级杆上,或直接偏离去检测器的轨道。四级杆分析器由四根杆组成,通常平行排列,材质为金属,比如钼合金。已投入

  了大量的技术和研究,设计开发四级杆。按照离子在DC和RF场中的运动,将质量分类。通过在软件上改变参数,系统可改变场强,在任何指定时间内,某一m/z值的离子被过滤掉,或通过四级杆到达检测器。相比于一些质谱仪的设计,比如飞行时间(TOF)质谱仪,四级杆分辨率较低。而四级杆相对简单,容易使用,是具有较高实用性的质谱仪,能以相对低的成本提供各种接口。

  在比较和说明MS的分析能力时,一些专业用语是必需的,在该入门指南的后续内容中将会给出完整的定义:

  分辨力(通常缩写为"res"-质谱仪分离两种质量的能力):

  - 低分辨力=单位质量=1000

  - 较高或中等分辨力=1000到10000

  - 高分辨力=10000+

  - 非常高的分辨力=高达3-5百万Fragmentation

  更详细的分辨率检查和我们怎样测定分辨率将在"质谱准确性和分辨率"章节说明。"精确质量"(Exact Mass)是化合物质量的理论值,而准确质量(Accurate Mass)是化合物质量的测量值,有相关的误差范围,比如5ppm。准确质量也经常用于针对具体的技术,而不是测得的质量。MS/MS - 描述了监测前体离子或碎片向产物离子转变的多种实验(多反应监测[MRM]和单反应监测[SRM]),总的趋势是在一台仪器上提高检测的选择性、专一性或灵敏度。即前后两个质量分析器,两极质谱分析在一台质谱仪器中实现。在三重四级杆质谱仪中有3套四级杆过滤器,但是仅有第1和第3套四极杆用作质量分析器。近来的设计完全将中间设备区分开(取代早期设计的四级杆),增加了更多的功能,通常将其改称为串联四级杆。第一套四级杆(Q1),作为质量过滤器,传输并加速选定离子,将其送向Q2(被称为碰撞室)。虽然在一些设计中,Q2类似于其它两套四级杆,RF施加在杆上的作用仅是传输,而不是质量选择。Q2中的压力较高,离子在碰撞室内与中性气体相碰撞。结果经CID发生裂解。碎片随后加速进入Q3,另一个质量过滤器,离子被排列后,进入检测器。

  裂解CID也称为碰撞激活解离(CAD),为一种裂解机制,通过该机制在气相中,分子离子裂解,通常在真空区域经电势加速到高动能,接着与中性气体分子碰撞,比如氦、氮或氩。部分动能通过碰撞而转化(或内化),这引起化学键的断裂,分子离子减小形成较小的碎片。一些类似的‘特别目的'的裂解方法,包括电子转移解离(ETD)和电子捕获解离(ECD)。

7.jpg

  图 7:硫丹-β产物离子质谱图。237Da的前体离子从左边进入,在MS/MS碰撞室内裂解。关于MS谱的全扫描,数据系统仅能够显示目标碎片(不是得到的所有碎片),得到相对简单的图谱。您能控制破碎的限度,因此您能选择前体离子。

8.jpg

  图 8:MRM响应(左)和SIR响应(右)的比较图表明,由于基质的化学背景,被测物即使在溶液中,也不能由SIR数据确定被测物峰。使用相同的GC/MS/MS质谱仪,选择m/z=146的丁基化离子作为前体离子,裂解该离子,得到产物离子(显示为57m/z),定量鉴别它的存在。在一些控制工业中,为了满足阳性化合物的鉴别要求,每个MRM计为1.5"鉴别点",而每个SIR计为1.0。因此,为满足选择性要求,得到3"IPS",每个化合物您需要2个MRM转换,或3个SIR。扇形磁场,或扇形磁场质量分析器,是早期仪器,一直用到现今,尽管用的较少(已被现代的能以ESI电离模式工作的质谱仪取代,)。例如,Waters AutoSpecTM,广泛用于极端高灵敏度的二英分析。

  扇形磁场弯曲成弧形离子轨道。离子的"动能与电荷"比率决定了轨道的半径,可通过电或磁场测定。较大m/z的离子比较小m/z通过的轨道路径长。通过改变磁场强度,可控制轨道路径。双聚焦质谱仪可按各种组合方式,将磁场和电场结合起来,但扇形电场后接磁场更常见。两种场最初联用时,按照离子流出离子源的动能采用扇形电场聚焦离子。角度聚焦之前的能量聚焦,使相同质量,但分子式不同的离子实现分离。离子阱和其它非扫描质谱仪离子阱质谱仪的原理类似于四级杆质谱仪。不同于过滤式的四级杆质谱仪,离子阱和功能更强的离子回旋(ICR)质谱仪一样,将离子存储在三维空间中。在饱和之前,离子阱或回旋加速器将选定离子射出以进行检测。在离子阱范围内,可实现一系列实验分析,裂解目标离子,通过形成的碎片,以准确的确定前体离子。RF电压产生的电场作用于排列成"三明治"几何构形(端盖相对的端盖电极)离子阱的两电极之间的空间。扫描RF电压,改变某离子的固有频率使其逸出。有时动态范围不宽。离子阱对捕获存储离子的有限体积和容量,限制了该种质谱的使用范围,尤其对于复杂基质中的样品。离子阱质谱仪于1980年推出,但是早期这类质谱仪采用内部电离,具有一定的局限性,限制了其在很多领域的应用。仅当出现外部电离技术后,这类质谱仪才得到了越来越广泛的使用。多级碎裂的能力,从一个被测物中可衍生出更多结构信息(即,碎裂-碎片离子-选择-特定片段-碎裂,并重复这一过程)被称为MSn。GC色谱峰不够宽,不允超过一个碎裂过程的进行(MS/MS或MS2)。离子阱质谱仪的MS/MS分析或裂解是根据时间,而不是空间,与四级杆和扇形磁场相同。因此,离子阱不能用于某些MS/MS分析,比如中性丢失和前体离子的比较。而且,在离子阱质谱仪的MS/MS图谱中,低质量端约1/3母离子m/z的碎片离子丢失,这是离子阱设计本身造成的结果。为了抵消这一损失,一些制造商通过软件加宽扫描要求弥补了这一损失。加宽扫描要求在数据采集时转换工作参数。

  离子阱的设计设置了前体质荷比(m/z)和最低俘获碎片离子之间的比率上限,通常称为"三分之一规则"。例如,一个m/z1500的母离子,其m/z500以下的碎片离子检测不到,这大大限制了多肽的人工测序分析。当太多离子进入离子阱的空间,由于空间电荷效应,动态范围受到限制。制造商已经开发了自动扫描技术,在离子进入离子阱之前,能够对离子进行计数,或门控制允许离子进入的数量。在大量背景离子共存目标离子很少时,仍然会遇到困难。因为功能设计类似,杂交型串联质谱仪吸收了四级杆和离子阱两方面的长处,提高了灵敏度,并可以进行快速实验分析,实现两种质谱仪单独使用不能实现的功能。这种质谱仪有时称为线性离子肼(或Q-TRAPs)。线性离子阱质谱仪离子阱体积的增加(与三维离子阱相比),提高了动态的范围。离子阱质谱仪不能像四级杆质谱仪那样扫描,因此使用单离子监测(SIM)或单离子记录(SIR)技术不能像四级杆和扇形质谱仪那样提高离子阱的灵敏度。快速傅里叶变换离子回旋加速器(FTICR)具有极高的质量测量能力,能够分辨紧密靠近的质量。虽然对大多数应用还不可行,但是14.5特斯拉的磁场能够取得超过350万的分辨率,因此能够区分质量相差小于单个电子质量的化合物。回旋加速器采用恒定磁场,通过静电平衡作用捕获离子。RF电压脉冲引起轨道离子运动,然后,在轨道上运动的离子在捕获单元的检测板上产生一微弱信号(离子轨道频率)。该频率与离子的m/z成反比,信号强度与单元中该m/z离子的数量成比例。在非常低的气压下,回旋加速器能够保持恒定的离子轨道,这样在长时间里,都能够进行超高分辨率的测量。持续非共振,辐射(SORI)是在傅立叶变换离子回旋共振质谱技术中使用的CID技术。在回旋加速运动中压力增加,离子被加速,引起碰撞,得到离子碎片。离子裂解后,压力减小,恢复高真空,以分析碎片离子。

  TOF质谱仪已开发多年,因其快速、准确的电子组件和现代的电离技术(如ESI),已成为很多现代研究工作的基础。TOF质谱仪能提供准确的质量测量,误差范围是分子真实质量的几个ppm。TOF质谱仪为时间分散质量分析仪,使用时以线性方式,或需静电网格和透镜(作为反射板)的辅助。当以反射式操作时,分辨率增加,且无灵敏度的显著损失,或不需要增加飞行管(或漂移管)的大小。

9.jpg

  TOF分析通过脉冲加速一组离子到达检测器。离开离子源后,每个离子从"推进"电得到一个相同的电荷或电势,离子被加速射进超低压管。因为所有带类似电荷的离子具有相同的动能(动能=mv2,m为离子质量,v是速度),在撞击到检测器前,较低质量的离子具有较高的速度和更小的间隔。因为质量、电荷和动能决定了离子到达检测器的时间,离子的速度可表示为v=d/t=(2KE/m)1/2。离子通过指定的距离(d)的时间(t)取决于质荷比(m/z)。因为每次 "电压推动"后,TOF测量的是所有质量数,所有相对于扫描型质谱仪,TOF质谱仪可得到非常高的灵敏度。如今,四级杆MS系统常规扫描速度为每秒10000Da(或原子质量单位)。因此一次全扫描,即使持续时间短的一次扫描(例如,1秒钟的LC或GC峰),在每秒内捕获每个离子的次数达不到10次或更多。TOF质谱仪检测器记录离子轰击检测板的数目,轰击彼此间隔时间为纳秒级。当直接与扫描质谱仪(比如四级杆)相比较,TOF的分辨率扩宽了动态范围,提供更高的分辨率。总的来说,当检测复杂混合物中的目标被测物时,四级杆类的仪器更灵敏感,通常是更好的定量工具。一些仪器,像离子阱,具有组合功能,但直到杂交型质谱仪出现前,没有单个质谱仪表现出全方位的高效性能。早期的MALDI-TOF的设计加快了离子离开离子源。该技术分辨率相对低,准确性有限。延迟提取技术(DE)是为MALDI-TOF质谱仪开发的一项技术,在离子形成后,加速离子在进入飞行管之前冷却"并聚焦离子大约150纳秒。与未冷却的离子相比,冷却的离子具有较低的动能分布,当冷却离子进入TOF分析器时,降低离子时间展宽,结果增加了分辨率和准确度。DE对大分子成效不显著(例如,蛋白质>30000Da)。

10.jpg

  图 10:适合的指定条件下(比如,无基质干扰),当选择扫描模式工作时,TOF比串联四级杆的灵敏度高很多倍,因为TOF不用‘扫描',不会牺牲"占空比"。

  杂交

  "杂交"适用于各种质谱仪设计,杂交技术是现存技术的集成,比如双聚焦、扇形磁场和近来的"前端"回旋加速的离子阱。最值得注意的一种杂交方式是四级杆飞行时间(QTOF)质谱仪,将TOF质谱仪和四级杆质谱仪组合在一起。这种是几种性能特征的最佳组合:准确的质量检测、裂解分析的功能以及高质量的定量分析。

11.jpg

  图 11:具有TriWave的SYNAPT 高性能质谱仪。

  串联质谱技术的进一步发展,产生了离子迁移率测量和分离相结合的串联质谱技术技术。离子迁移率质谱法(或IMMS法,通常缩写为‘IMS')是基于多种因素的组合来区分离子的技术,这些因素包括:离子大小、形状、电荷和质量。IMMS通常在机场和手持领域的元件中使用,可对迁移率已知的小分子实现快速(20毫秒)检测:例如某些毒品和炸药的检测。当采用更高位的质谱仪,IMMS提供正交分离(对LC和MS),以及一些独特功能,包括:

  - 分离异构体、同重化合物和构象异构体(从蛋白质到小分子),测定其平均转动碰撞横截面。

  - 增强复杂化合物的分离(通过MS或LC/MS),引起峰容量增加和样品清洁度的增加(离子的物理分离,尤其是化学噪音和干扰目标分析物的离子)。

  - 在结构分析研究中,通过CID/IMMS、IMMS/CID或CID/IMMS/CID等性能获得更多有用信息。

  在所有的3个分析方案中,高效离子迁移率和串联质谱法的组合有助于克服分析中存在的问题,其它分析方法,包括传统的质谱分析法或液相色谱测试设备,可能也无法解决这些现存的问题。

  在本章结尾引用了H.H.Hill Jr.等人的评论文章,比较了各种类型的离子迁移率(到文章2007年出版时,可用到的质谱仪),并描述了对各种被测物应用离子迁移率的益处。目前在质谱分析中,应用的4种离子迁移率分离方法:

  - 漂移时间离子迁移率质谱法(DTIMS)

  - 吸入离子迁移率质谱法(AIMS)

  - 差异迁移率质谱法(DMS),也称为不对称场波形离子迁移率质谱(FAIMS)

  - 行波离子迁移率质谱(TWIMS)

  按照作者的观点,"DTIMS能提供最高的IMS分辨力,它是仅有的(IMMS)能够直接测量截面碰撞的方法。AIMS是低分辨的迁移率分离方法,但是它只能连续监测离子。DMS和FAIMS具有连续的离子监测能力,以及正交离子迁移率分离的功能,能够实现高分离选择性。TWIMS是一种新(IMMS)方法,其分辨能力相对低,但具有较好的灵敏度,能很好地与商品化的质谱仪工作结合。"

12.jpg



  图 12:用彩球表示的,不同迁移率的无差异离子被俘获、累积,然后释放到T-波离子迁移率分离(IMS)装置中。

  

13.jpg

  图 13:一旦释放进入T-波区域,行波波形驱动离子通过中性缓冲气(通常是0.5毫巴的氮气),按照离子迁移率分离离子。

  14.jpg

  离子迁移与MS联用,也应用在生物分子气相结构的研究。Pringle等(在此引用)应用杂交型四级杆-行波离子迁移分离器-正交加速TOF质谱仪,考察了一些肽和蛋白离子的迁移率分离。将从行波(TWIMS)分离设备上获取的离子迁移率数据与使用其它类型迁移率分离器获取的数据比较表明:"当迁移率特点类似时,新的杂交技术的质谱仪提供的迁移率分离不影响质谱仪的基本灵敏度。该功能在显著分析水平上有利于样品迁移率的研究。"

  数据处理

  将离子强度求和,然后按总离子强度对时间(色谱保留时间)的函数作图,得到总离子流色谱图(TIC),该图非常类似于分光光度计的输出,如UV检测器。对MS而言,一条轴表示离子强度;另一轴可以是时间或特定时间的数字采样值(比如:图谱)。您能单独显示每一张图谱,非常类似于数码摄像机拍摄的一系列图像,从本质上讲,是一系列高速静态照片。可能有简单的但非常有用的技术,例如,在选定离子的色谱图中,降低数据阵列,或使用数字过滤器降低噪音,这样您可以仅显示出每个数字样品中的最强峰(基峰离子色谱图或BPI)。数据输出、存储和检索多年来,软件设计已成为独立的专业,不再是简单设置数据采集参数的途径。现今,操作和数据系统允许操作员进行复杂的仪器控制。

  这些专业的软件包得到了显著的发展:

  - 工作流程控制,比如开放存取(OA),也称为"上行系统",一位接受了全面培训的操作员能够建立完整的LC或GC/MS方法,大量非专业用户可使用这些已建立的方法,这样,非专业用户不需大量培训便能使用先进的技术。非专业人员可能只是偶尔使用质谱仪,确定化合物的特性或纯度。这种系统方便了非专业人员的使用,使用仪器时,不用首先成为娴熟的操作人员。

  减少数据的应用-这些软件包有助于在复杂混合物中,从成千上万个独特化学个体里鉴别代谢物或开发生物标记物。通常使用"专家"系统,可以扩大该应用,比如说主要组成分析软件(PCA),它检测出趋势,而不是大量输出具体的数据。数据管理的需求远未得到满足。高分辨率、质量数准确的数据将产生多达1GB/ h的数据。这样巨大的数据不仅仅来自生命科学的研究,而且越来越多地来自工业领域的研究工作,这类工作依赖于高容量的数据处理过程,比如代谢物和其生物转化过程的表征。5台质谱仪运行180天,每天每台能产生24GB的数据,这些数据需要存储、检索、分类,生成信息的数据达21.6 TB。

  在任何数据方案中,必须说明的首要问题是怎样使用采集的数据?不像传递信息的电子邮件,传递信息之后几乎不起任何作用,当生物、医药和物理化学测量值在数据文件中不停地累集,在线数据值随着时间而增加。但是随数据量增加,也增加了数据访问的代价。由于数据文件大小增加,访问数据的时间随之增加,一种解决途径是包括某种形式的分级存储管理。这样,一小部份数据将能快速访问,或"激活",而余下的数据以连续分级处理或被指定长期存档。质量准确性和分辨率提高被测质量数的准确性和分辨率是现今结构表征的各项应用中的主要工具,应用范围已不再局限于早期药物发现。由于QTOF具有广泛的特异性和效用,其正逐步取

  代其它LCMS技术。

  QTOF质谱仪具有高的质量准确性,误差为真实值、计算值、单同位质量值的几个ppm;高分辨率-比四级杆质谱高10倍-允许我们根据质量缺失(在此,氢和其它共存原子的质量值起到区分作用)确定经验式。物种形成分析,例如辨明乙醛和硫化物之间的不同,使用质量准确性高于四级杆(质量精度为30ppm)的质谱,可以辨明其差别。在此例中两种物质质量数相差0.035Da

  但是,包括甲基化在内的代谢过程之间的区别,越来越有挑战性。增加CH2将前体(仅对药物的响应)的测量质量增大+14.0157Da,与之相比,在两步生物转化中,涉及羟基化(增加氧),及随后的双键氧化(失去H2),测量质量增大+13.9792Da。可见,当使用整数分辨率时,两种代谢方法对其代谢产物的测量值将同为+14Da。

  质量准确性和分辨率

  高质量准确性和低分辨率

  对于高质量准确性的测量,低分辨率的四级杆质谱仪表现性能良好,比如将其应用到蛋白质的分析中:当同位素峰相对彼此,没有被分辨出时,蛋白质的质量通常定义为"平均"值。平均质量是分子中所有同位素离子的加权平均值。通常使用在四级杆质谱仪上的仪器分辨率扩大分辨响应,对10kDa的蛋白,乘以1.27的因子。所乘因子随质量数增加而显著增加(例如,100kDa乘以2.65)。不过,减小峰宽到m/z0.25(增加分辨率到4000),而不是将质谱仪分辨率限制到1000,即使用峰宽m/z0.6,能显著提高信号强度。实际工作中,大分子的ESI-MS分析能得到多电荷离子。因此,峰宽需要除以离子的电荷数,以得到在该质荷比的峰宽。

  例如,带有10或20个电荷的20kDa蛋白质将产生一个多同位素离子共存峰,在m/z大约为2000或1000,各自对应的峰宽为0.9或0.45m/z单位。当这些离子在质谱仪上实测时,将分辨率设置得非常低,显著低于分辨同位素所要求的分辨率(分辨率低于10000),对每个带电状态,将得到单一的峰。由单一同位素峰峰宽的理论值除以离子所带电荷数的值,结合质谱仪峰宽,确定总峰宽。由相同m/z值的低分子量化合物的第一个同位素峰来确定,并将其作为多带电蛋白质的峰。

  我们需要多大的质量准确性?能否实现,折中方案是什么?

  考虑美国质谱学会杂志作者指南中明确表征的要求(2004年3月)。对只含有C、H、O、N的化合物(C0-100,H3-74,O0-4和N0-4),在整数质荷比为118,响应误差不超过34ppm时即可明确确定其化学组成,而在整数质荷比为750时,响应准确性需好于0.018ppm,以消除"所有外部的可能性"。

15.jpg

  图15:对于化合物的明确鉴定,增加质量准确性的效益。(Quenzer,T.L., Robinson,J.M., Bolanios,B., Milgram. E. 和Greig, M.J.(作者),使用FTICR质谱进行自动准确的质量分

  析,关于质谱和相关主题的50周年会议论文,Orlando, FL, 2002).

16.jpg

  图16:对指定结果,在数据分析中增加过滤提条件或限制误差,降低可能的候选物数量。

  仪器间精确度的比较:毫质量单位[mmu],测量误差[ppm]和分辨率

  按照VIMMS计划的准确质量最佳实践指南(为起始计划,构成了部分英国测量体系),准确质量测定的绝大多数仪器要求能够实现10ppm或更佳的精确度。准确度在2mmu之内的现代质谱仪,对计算质量为118Da的物质进行测量,结果出现17ppm的误差,按照今天的标准,明确确定化学物质的分子式,这一误差已经能满足要求:

  计算得到的单同位素准确质量 = 118 Da

  测量的准确质量 = 118.002 Da

  偏差 = 0.002 mmu

  误差[偏差/准确质量x106] = 17 ppm

  一台质谱仪对750m/z产生响应,准确度也为2mmu,误差将达到2.7ppm。在第一种情况下,按照美国质谱学会杂志的发行标准,对化合物分子式的明确鉴别,测量已经足够。但是对后一种情况,测量不够精确。只有最高效的傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR),对较高的质量,实现这样的精确度。一种评定仪器质量准确测量能力(类似于预期使用)的综合方法,通过均方根或均方根误差测量(RMS)误差计算。从商业化的TOF质谱仪的质量测量准确要求中选取了下列内容,说明它怎样使用。

  "在通常工作条件下,仪器的质量测量准确性,在指定的m/z范围内,将好于指定ppm RMS,这是基于被测物峰(属于指定m/z)大量连续重复测量并选择适合的参照峰(属于指定的m/z)得出的结论。被测物和参照峰必须有足够的强度,不受其它物质的干扰

  有一些关键点和假设需要考虑:

  1. 按照校正标准,已经用已知质量的峰对仪器进行了校正。参照峰被用于解释仪器随时间校正中出现的任何改变,并使用被测物峰确定质量测定的准确性。

  2. 正常的工作条件也包括在色谱条件的细节(LC/MS性能的说明)与任何相关的MS工作条件(例如,质量分辨率、目标m/z或质谱采集速率)。

  3. 强度足够假定离子数,对考查中的质谱仪(质量测定)准确性和精确性的表征不造成有害的影响。离子过少不利于离子的统计,离子过多会引起检测器饱和,这两者一起作用,将引起重复测量的标准偏差出现更大的改变,将反向影响RMS误差的计算(也与仪器校正相关)。

  4. 无干扰-假定已知质量峰的质量测定不受相同或相似离子的干扰。重叠峰造成质量测定的准确性较差,这也不利于质谱仪准确性或精确性的正确表征(也与质谱仪的校正相关)。

  5. 参照是m/z范围的好的表示法,这与特定样品类型的分析相关。使用下列关系式,计算RMS误差,在此Eppm是ppm误差,n是考察质量的数量:

  RMS误差不允许一些测定落在ppm误差的"目标窗"之外(例如,5ppmRMS)。为了确保测定的质量,对大量重复进样,以上描述的条件需要得到满足(尤其关于强度和干扰物的影响-在图谱中具有清楚的峰轮廓的平衡离子统计)。您所见的报告的很多分辨率和质量准确性的数值不是RMS误差值,而是来自单个选定(适合的)的离子。记住这一点很重要,在所有的应用中,弱信号产生不好的离子统计数据,因此是不能用的。过强的信号同样不适合使用,造成检测器饱和。理想的平衡离子统计数据,在图谱中具有清晰度,这是分析的目标。一些比较:

  关于图17:

  - 四级杆分辨率不能完全区分两种化合物。

  - 分辨力大约为5000,TOF数据清楚地显示两明确的峰,能够准确的进行质量测量,误差小于5ppm。

  在准确质量数的精确度中,通过质量定义的改变、提高的分辨率和诸如峰形和校正需求等因素理解各种内部的相互作用,这一点很重要。如果不能清楚地理解这些,没有考虑到质量的误分配,那么将会出现其它意想不到的结果。

17.jpg

  图17:重叠图谱表明四级杆和TOF产生的响应,在TOF数据中两种质量值处于1mDa的准确质量范围之内。在图中,不同组分的两种碎片来自相同的被测物,并且同时处于离子源。对这种情况,采用最佳的色谱法也不起作用,因此需强调一点,较高的分辨率是有用的,尤其对未知分子的分析。这同样完全适合于QTOF产物离子数据与三重四级杆产物离子数据之间的比较。较高分辨率的另外的一个好处是,允许含氧和含烷基被测物的提取离子电流(XIC)图从总色谱图选择性地被提取而区分,四级杆数据由于分辨率低,做不到这一点.

18.jpg

  图 18:当质量增加时,相对于峰高来说,要正确确定单同位素质量和平均质量,分辨率变得越来越重要。

  质谱仪输出解析

  质谱图显示出试验中特定时间出现的特有离子,持续时间表示固体样品在离子源长时间的烧蚀,或表示短暂的GC或LC峰的通过。软件对几种离子源有效。对具体的应用通常设计对应的软件,比如代谢物的鉴定。软件是迅速而有效的工具,能迅速处理大容量的数据,同时找出肉眼可能忽视的问题。软件能利用适当的技巧,利用基本的化学性质,帮助我们减少不确定性:含氮化合物的价电规则、卤化物特征光谱、环双键的计算等等,以得到我们认为确定的结论。没有任何单个应用软件能够满意的解答所有的问题。因此,实际能够依靠的是操作人员所掌握的技能和判断的能力。

  简单的小分子,比如二氧化碳(44Da),仅由3个原子组成,产生非常简单的质谱。对于CO来说,分子离子也是最强的离子(称为基峰)。在这张由大量内部能量电离得到的碎片离子的谱图中,出现的碎片离子是CO(m/z=28)和O(m/z=16)。在一些情况下,谱图中,分子离子可能不是最强的峰。例如,在丙烷中(44Da),因为碳碳键的断裂,得到甲基和乙基碎片,乙基阳离子(m/z=29)是最强峰。这些很好表征了相互作用的离子,对这些碳氢化合物的谱图识别是非常有意义的。

  同位素特征

  因为质谱仪按质量数分离离子,当质谱仪具有足够的分辨率,对指定元素区分同位素能容易的实现。通常以卤化物为例,例如自然存在的溴是由比例接近50:50的同位素原子质量分别为79和81Da的原子形成的混合物,Br2裂解成溴离子,在79和81m/z得到两个相等大小的离子峰。

  含偶数和奇数电子的离子

  大多数有机化合物的总电子数为偶数,因为电子成对占据原子轨道。当单个电子从分子中移出,总电子数变为奇数,成为自由基正离子。在质谱图中,分子离子通常是自由基阳离子(如在EI所示),但是碎片离子可能是偶电子阳离子或奇电子自由基阳离子,这取决于中性(未带电)碎片的丢失。最简单和最常见的裂解是价键的断裂,得到中性自由基(奇电子)和带有偶电子的阳离子。丢失一个偶电子的中性片段,得到一个奇电子的自由基阳离子片段,这种裂解很少见。奇电子离子可以裂解成奇或偶电离子,但偶电离子碎片仅裂解成其它偶电子的离子,这可作为一条规则。

  解析质量谱图的两个水平途径是整数质量数据和精确质量数据。在每种情况下,保留时间是附加的决定因素。准确质量的测定要基于计算得到的元素组成。为减少可能存在的候选分子式,结合运算法则的准确同位素模型是近来准确质量测定可利用的方面。

  解析和软电离谱图的表征

  当我们面对质谱时,逆Diehls-Alder反应和均裂/异裂释放的能量被用来解离或断裂化学键,产生特征碎裂,是我们思考的基础。MS比较困难的部分是要回答FredW.McLafferty所提出的问题,他对我们理解解析规则作出了重要贡献:"我们测量的质量是什么?"直到像MALDI和电喷雾等解吸技术开发后,该问题至少有时好像比较容易回答。容易程度要取决于是否样品需要衍生,增加挥发性,便于GC/MS分析。由此通常的得

  到谱图由衍生基团主导几乎没有分子离子(因此需要CI)。在那种情况下,电喷雾和APCI的出现无疑帮助了带但电荷小分子的分子量的确定。至少在那些情况下,MS测量的离子m/z值仅带一个电荷。测得的被测物质量作为分子离子的名义质量(名义m/z值),与分子的名义质量相同。离子、分子或自由基的名义质量是其元素组成中元素名义质量的总和。元素的名义质量是自然存在、最高丰度、稳定同位素的整数质量。

  当软电离解吸技术ESI在1990年代初开始广泛商业化时,该问题的回答变得更加不可捉摸。在MS"解吸技术出现之前"的年代,需要MS测定的大多数被测物的名义质量,不超过500Da。对这些被测物,氢的存在造成的质量缺失不是个问题。对绝大多数质谱仪,m/z的上限介于650-800。因此,在那些解吸电离技术出现前,名义质量和整数单同位素质量是相同的数值。离子、分子或自由基的单同位素质量是其元素组成中元素的单同位素质量的总和。元素的单同位素质量是最大丰度、自然存在、稳定同位素的精确质量。在解吸电离时代开始的时候,对较大分子和更高精确度的研究成为一个整体,因为技术不存在任何困难。仅在那个时侯,质量缺失的问题变得非常重要。在仅能测定最接近整数m/z值的质谱仪上,C50H102化合物的分子离子可以由m/z703的峰表示,不是m/z702,因为分子离子的单同位素质量为702.7825,取整的整数为703。

  500Da以上的测定中,在确定MS峰的m/z值时,质量缺失可能是个严重的问题。需要记住,不管使用什么m/z分析器类型,质谱仪是测量质谱采集过程中特定时间出现的信号强度。测得的m/z值是特定化合物产生的已知m/z值离子相对于校正化合物到达检测器时间的函数。

  因为单同位素离子的质量随m/z刻度位置的变化而改变得出m/z整数值的质谱仪实际上能够每隔0.05m/z单位进行测量。检测强度可以是质谱峰的顶点值或整个质谱峰的强度之和。测得的m/z值是对质量波谱峰最大值,实测m/z值取整。电子电离质谱通常取决于全氟化合物,比如过氟三丁烷胺(名义分子量为671),以校正m/z刻度。这是因为离子的整数质量几乎与其同位素质量相同。

  一旦离子的名义质量超过1000Da,在质谱图上没有实测的名义m/z值的峰。在此应当按与离子质量亏损相等的量检测名义质量峰,弥补单一同位素质量峰的缺失。对带单个电荷的离子,质量大于500Da,使用像电喷雾离子化结合四级杆或四级离子阱质谱技术,这类质谱仪在整个m/z刻度上具有单位分辨率,同位素峰可以清楚的分离。

  在化合物的鉴定中,关于同位素所起的作用有很多讨论,其中有一项讨论发表在欧洲LCGC杂志上,起到了有益的平衡作用。"小分子LC-MS的同位素峰解析"(L.M.Hill,洲LCGC 19[4],226-238[2006])基于低分辨率离子阱的研究工作。在该文章的相关部分,在使用离子阱时,作者对过度自信提出了警告:"相比于QTOF或三重四级杆系统,离子阱用户必须更加仔细。起始的+1同位素峰必须与污染物相分离...相比于离子阱的扫描分辨率,其俘获的分辨率更低...排空离子阱...按质量顺序。"这不是意味不能使用离子阱,像所有仪器一样,使用时必须理解其功能和局限性类似的,具有非常高分辨率的仪器,不能自动得到正确的答案。Kind和Fiehn论文中的一组数据(T.Kind和O.Fiehn,BMC生物信息学7234[2006])给人印象尤其深刻,并由此得出他们的结论(从160万分子式的研究搜寻得出的结论):"仅仅有高质量准确度(1ppm)和高分辨力是不足够的...仅有同位素丰度模式过滤器能够减小候选分子式的数量。"仅有3ppm质量准确度的质谱仪,2%同位素类型准确度,通常能剔除超过95%的假候选分子式。这一性能甚至能超过0.1ppm的质谱仪,如果这种仪器实际存在,那么也不具有同位素模式的功能。在质量介于150Da与900Da之间,没有同位素丰度信息,当质量准确度从10ppm提高到0.1ppm,可列出的可能分子式:质量准确度10ppm时,从150Da的2个候选分子式的低点,到900Da的3447个候选分子式。质量准确度在1ppm时,候选分子数的高点(900Da),将得到345个候选分子式。使用2%同位素丰度的准确度,在900Da的候选数减少到18个候选分子式。研究结果也表明,对同位素采集允许5%精确度和5ppm的质量准确度,将减少到196个候选分子式。

  定量与校正

  当化合物已知,像临床试验中,收集很多独立样品的统计数据,服用的药物和其目标代谢物已经完全表征,以上情况下不需要全扫描质谱图。但是,在复杂生理性的混合物中,要求非常高的灵敏度,因此设置质谱仪仅监测特定m/z值。(参见27页,SIR和MRM响应的比较)。因为离子连续流过三重或串联四级杆,所以没有必要限制离子流进入质量分析器。与之相反,离子阱有明确的有限容积,因此,需要防止过多的离子进入离子阱。不限制离子强度,结果在质谱图中会出现不想要的或意外的峰,这样当试图在GC/MS谱库中搜寻EI谱时将非常麻烦。离子阱的设计已经发生很大的改变,允许外部电离(在质量过滤器外获得离子,随后离子注入离子阱),而不是内部电离(在质量过滤器电离)。设计的变更带来了一个问题,在阱中会发生离子分子反应,但同时对离子流有一定限制。甚至在MRM模式下,这种总离子流的自动调节机制会引起对单个色谱峰的不规则采样间隔。因此,最终,在复杂基质的痕量分析中,离子阱具有一定局限性,尤其当要求有极高的准确度和精确度时,在这种情况下,因为数据必须具有合理性,或必须符合定量分析的准确度和精确度的严格标准。

  MS定量分析时,通常需要使用内标化合物。内标用于控制样品提取、LC进样和电离等过程的误差。如果没有内标物,各种重复试验中的RSD将比有内标物的重复实验高出10倍。最好的内标物是目标分子的同位素标记物。虽然合成这类分子非常昂贵,但是其有类似的提取回收率,色谱保留时间和质谱电离响应等。

  校正

  质谱学家使用校正化合物调整质量校正比例和离子相对强度,与已知被测物相匹配。所有质谱仪上都需进行这一操作,因为电子、表面的清洁度和实验室的周围条件可能影响质谱仪的有效测量能力。对一些在低分辨质谱仪上进行的要求不高的分析来说,校正可以较少,但仪器响应高低的检查要经常做。但是,高的质量准确度则要求对质量精度随时监控。

  对GC/MS,常用的校正化合物是FC-43,也称为过氟三丁烷胺。其它的校正化合物混合物也被用于调整高分辨率质谱的校正比例。碘化铯钠(NaCsI)和聚乙二醇混合物是LCMS的校正物。在LCMS兼容的溶剂中,NaCsI以稳定状态流入或加入到质谱仪中,在整个4000Da的范围内产生一系列单同位素峰,可用于质量校正。含有可选择的标准肽、蛋白质、基质和溶剂等,用于对MALDI质谱仪进行校正、调谐和灵敏度检测的有效工具包已经商品化。Sigma Aldrich®公司已经这样一种用于蛋白质和肽复杂混合物的分析(700到66000Da)的一套试剂盒。

  质量锁定

  对于一些在TOF或类似的高质量精度的仪器上进行的对质量精度要求较高的测定时,需要随时严格监控仪器状态。温度的微小变化,可能导致质量数几个ppm的偏差。根据使用电离类型,使用一些一直存在的已知污染离子,可实现连续的质量校正。或者在整个分析过程中,对离子流定期取样,以实现随时校正。如果在色谱柱后,质谱进口之前的LC洗提液中,添加用于质量锁定的校正物,这通常引起不可控的结果,比如离子抑制,质量数干扰和溶剂效应等。TOF型质谱仪(第26页描述)能实现较低ppm的质量精度,对于傅里叶变换离子回旋共振(FTICR)质谱仪,如果控制进入系统的离子数,则可达到更高的质量精度。通过质量锁定对质量数实时校正可以去除用事先已建立的质量比例校正的质量误差。信号较弱有时是另一易被忽略的原因,可通过对LC峰各采样点进行平均进行校正。双电喷雾源是蛋白质组学研究或低水平代谢物鉴定的理想电离方式。这种方法使用两个独立ESI探针,使用可编程的步进马达驱动的振荡阻隔板,从校正喷雾(或参照)流中取样。在预设的间隔时间内从对照喷雾取样,并确保样品采集任务循环。取样阻隔板的位置被实时监测,以便指示出两液体的入口,对照和样品数据存储在独立的文件中。这种设计减少了被测物和参照物的相互影响。
回复此楼

» 收录本帖的淘贴专辑推荐

SCI的基础与成功之路 多肽技术咨询 2222 药代动力学
3D-docking

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

HAOXUE-1

禁虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
本帖内容被屏蔽

2楼2016-03-15 16:09:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cat_and_fish

木虫 (正式写手)


感谢分享!!!谢谢!
3楼2016-03-15 17:00:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
送红花一朵
4楼2016-03-17 11:16:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

李小婵

捐助贵宾 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
200782060: 屏蔽内容, 学术交流版块,禁止发布广告内容 2016-03-22 17:06:41
本帖内容被屏蔽

5楼2016-03-22 16:03:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
6楼2016-04-20 20:38:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qxy7721

银虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
送红花一朵
特别感谢,正需要这样一份材料
7楼2016-06-20 09:56:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xin1990yi

金虫 (正式写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
不错的资料,收藏了,多谢楼主分享。
8楼2016-06-24 21:41:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
9楼2016-07-07 16:33:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
谢谢分享
10楼2016-07-30 15:01:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 wy19871124 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 外导问:现在华盛顿CSC的资助是多少钱啊?求助!!! +4 Ice_Libre 2017-12-13 6/300 2017-12-13 06:02 by fushaoyan328
[硕博家园] 你选哪一个? +52 啊啦嘞 2017-12-12 58/2900 2017-12-13 00:14 by 飘过的晚辈
[基金申请] NSFC-河南联合基金,已中!附截图 (金币+2) +27 cityfriend 2017-12-08 31/1550 2017-12-12 20:29 by mtong2004
[公派出国] [爱丁堡大学]导师回复,头衔Lecturer,影响。 +9 649391097 2017-12-10 18/900 2017-12-12 19:44 by 王qiqi
[找工作] 郑大VS华水VS河工大 +11 xijunxu2009 2017-12-11 13/650 2017-12-12 19:38 by 2012050918
[硕博家园] 请各位虫友推荐主成分分析+聚类分析的工具书 +7 口十米子 2017-12-11 13/650 2017-12-12 18:12 by 口十米子
[考研] 在读生能考研吗? +7 Jack TW 2017-12-08 8/400 2017-12-12 15:16 by wdkwolf
[公派出国] csc申请千人是不是会直接被pass +10 梦泽之安 2017-12-09 10/500 2017-12-12 06:09 by wulanyingzi
[考研] ☆首发——2018肖四选择题详解 +16 zhy19921203 2017-12-08 17/850 2017-12-12 03:33 by littleMackLi
[考研] 求问应用化学考研 +4 那时阳光暖 2017-12-11 6/300 2017-12-12 01:03 by lin凌
[教师之家] 怎么增加房间湿度?? (金币+2) +40 lydiayoyo 2017-12-10 41/2050 2017-12-11 21:59 by jiaoxiaoyu
[考博] 考博 +5 S嘻嘻哈哈 2017-12-06 11/550 2017-12-11 18:42 by 开飞机的贝塔
[考研] 关于政治分析题的背诵问题 +8 笑拥冷风 2017-12-10 17/850 2017-12-11 12:10 by 笑拥冷风
[论文投稿] 审稿意见回来了,但是文章状态还是Review(open) 3+4 刘晶晶lvyy 2017-12-10 5/250 2017-12-11 12:00 by peterflyer
[硕博家园] 读博受歧视 (金币+2) +20 Barrad 2017-12-10 23/1150 2017-12-11 10:53 by wswmingy
[硕博家园] 买二手房需要注意什么事项? +12 apple6699 2017-12-09 23/1150 2017-12-11 08:06 by wbaobao8276
[硕博家园] 这样的博导 +5 Barrad 2017-12-10 16/800 2017-12-10 23:35 by Barrad
[硕博家园] 觉得做人还是差点意思 +9 xiaoxiao1231 2017-12-08 17/850 2017-12-09 15:20 by 1063429862
[教师之家] 教师资格证 +3 1768624049 2017-12-07 4/200 2017-12-08 08:44 by 潇湘小昆虫
[有机交流] 这个机理实在搞不懂,请大家帮忙解答! 5+3 YANGHAO1968 2017-12-07 9/450 2017-12-07 19:54 by 1415146521
信息提示
请填处理意见