肺克基因敲除问题
本人采用red重组敲除,目的片段750bp左右,先电转入含四环素抗性的pKD46质粒,然后用阿拉伯糖诱导重组酶表达后制作成感受态,电击转化入重组片段(含上下游同源臂各250bp,卡那霉素抗性基因作为插入片段,总长2000bp),但是第二天平板上都没有菌落生长
考虑问题:1.重组片段是不是太长,与目的基因长度相差太大导致重组失败
2.电转效率低,当时电转质粒时只获得一个克隆,可能是感受态制作不行?肺克荚膜很厚,离心的时候很难离到底,是否有解决方法?能否用固体培养基做阿拉伯糖的诱导?
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