质粒pYES2转化酵母没有转化子出现
各位前辈:
我最近在做酵母的转化实验,用到两个质粒一个是cas9质粒一个是pYES2质粒,用醋酸锂转化法,具体方法如下:
1. 挑取单克隆酵母BY4741于10 ml YPD培养基中,30℃,250 rpm过夜培养。
2. 测定过夜培养之后的OD600,转接于50 ml YPD培养基中,使初始OD600=0.4,细胞数目约为5×106 。继续培养2-4 h,使OD600=1.3-1.5,细胞个数约为2×107。
3. 用50 ml 离心管,2500 rpm,5 min 离心,收集菌体,在40 ml 1×TE悬浮。
4. 2500 rpm,5 min 离心,去上清,收集菌体重悬于2 ml 1×LiAc/0.5 TE 中。
5. 在室温下静置10 min。
6. 然后依次加入1 μg的质粒,100 μl的酵母悬液,700 μl 1×LiAc/40%PEG3350/1×TE,剧烈振荡1 min 。在30℃情况下孵育30 min。
7. 加入88 μl DMSO,混匀,在42℃下热激7min(或20 min-25 min)
8. 2500 rpm ,5 min 离心,去除上清,在200 μl 1× TE中重悬。
9. 涂布于选择培养基含有G418的培养基(G418浓度:200 μg/ml)
10. 将平板在30 ℃培养2-3天。
可是连着做了几次了平板上都没有转化子出现,想问下大家问题出在哪里了,或者有什么可以改进的地方吗. 返回小木虫查看更多
菌株确定没问题吧,转化平板没问题吧
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祝好运