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菌液跑pcr几天了都有很多杂带

作者 furybeta
来源: 小木虫 350 7 举报帖子
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和同学用的一样的大肠杆菌菌液

同学做的鉴定试验 都跑出了目的条带且成功

(所以感觉不是菌液的问题)

我做的耐药基因检测 每次都有很多杂带

用的引物是文献里找的 且他们都成功了 温度是结合了文献温度和建议温度(但他们都是用dna跑的pcr 我是用菌液跑的 mix用的不同)

菌液1微升 上下引物各1 mix12.5 ddH2o 9.5

pcr温度

98度 3min

98度 10s 55度 10s 72度 15s (30个循环)

72度 2min

10度 30min(保温)

(但文献前俩是94度 老师说这个没影响…)

老师让我优化实验

比如优化温度等 我提高了一点 还是不行

我在想我要不要做一个梯度pcr找出最适温度

还是说我的其他步骤有什么问题吗

求大神指导

好迷茫

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  • 精华评论
  • yu58

    之前有看到贴子说菌液中的盐会影响PCR,菌液离心在用超纯水洗两遍,再PCR,我还没实验过,不知道对于你的问题是否有用

  • 若雪心漩

    pcr程序是根据你买的酶的产品确定的,98和94影响还是很大的,要参考产品的说明书进行pcr

  • jianghuqixia

    换引物,文献引物不靠谱,你可以自己多设计几对,又没多少钱,提高引物的专一性

  • wanglei512

    梯度PCR仪跑一次不就搞定了,为啥要每次提高一点温度,第一次扩曾的基因直接做7-8个温度梯度
    文献中的引物不一定就是最好的,有的可能漏写了一个碱基,直接在NCBI里找目的基因,可以自动给出好几条引物,都不用自己设计,

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