双酶切构建pGADT7载体出问题？求助
给位大神求指点
我目前正在构建一个pGADT7的载体。目的片段是1300bp（胶回收浓度不是很好20ng/ul左右），采用的双酶切方法，就是在目的条带两段设计引物的时候加上酶切位点。然后先连到 simple pEASY载体上测序。测序正确后，双酶切测序载体和pGADT7，然后过夜连接，次日大肠杆菌转化。做菌落PCR，在做菌落PCR的时候发现用特异性引物+载体引物能扩出来。用两个载体引物扩不出来。那应该就是没连上对吗？怎么解决呢？
酶切体系50ul（用的全式金的EcoRI和BamHI)酶切目的条带时：PCR胶回收产物和连测序载体的都酶切了）
DNA 5ul
Buffer 5ul
EcoRI 1ul
BamHI 1ul
ddH2O 38ul
37℃反应2小时
连接体系10ul(诺维赞的T4连接酶）
10*Buffer 2ul
片段 5ul
载体 0.5ul
T4连接酶 1 ul
ddH2O 11.5ul
反应条件16℃过夜连
拜托各位了。帮忙指出错误
返回小木虫查看更多
今日热帖
京公网安备 11010802022153号
特异性引物+载体引物是什么意思，两个载体引物又是什么意思
特异性引物是扩片段的引物
载体引物就是pGADT7的通用引物啊
通用引物形成二聚体？或者退火温度用的不合适？
用 通用引物扩确实有引物二聚体。但是一点也没扩出来，感觉很不正常。我做了三个基因，都是这种情况。退火温度是根据引物来的，设置的60℃，应该也没问题吧？
那请问如果像您说的通用引物形成二聚体这种情况要怎么解决呢
，
用特异性引物+载体引物能扩出来，说明你克隆很可能是成功的。连上了
用两个载体引物扩不出来，原因有很多，比如片段太长，更可能的是你的引物不好用，就算没连上也会有比较小的带。
挑菌，提质粒，然后酶切或测序。