Gibson连接和T4连接酶连接总是把不成功
目前在构建一个载体，用了两种方法：一个是Gibson连接，将骨架双酶切切开，然后将与骨架带有同源臂的片段用Gibson酶连接，然后再转化，菌落PCR验证出来的条带和我的目的条带总是不同，送去测序也不对；后来改用在连接片段前后加上酶切位点和保护碱基，转化出来的板一个菌落都没有。将片段送去测序也没有发现什么问题，感受态也没问题，这个实验反反复复做了快两个月了，就是没有进展。哪位大神能够给点思路，我号继续往下做。谢谢啦！@天使托
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模板和目的基因浓度高不高？
不太高，在做T4连接的时候，骨架浓度只有10ng/ul,片段浓度是37ng/ul,骨架和片段比做了1：3和1:5两种体系，转化后就是不长。还有就是我双酶切后可以直接用Gibson连吗
，
双酶切后尽量纯化一下子吧，浓度高的话连着会高效
纯化了的，过夜酶切后都有做纯化。找了好多原因就是找不到问题的关键所在。
首先，Gibson连接是不依赖于限制性酶切位点的克隆方法，具有5->3外切酶活性的酶能将线性化的载体和插入片段相同的同源臂消化（chew back）产生相同的黏性末端（长度一般15-40nt），再用T4 DNA连接酶连起来。既然能用双酶切做克隆，那肯定首选酶切连接。酶切的作用也是产生相同的黏性末端。
请问后来有解决Gibson连接效率的问题吗？
我的质粒重组必须要用Gibson，但是Gibson涂得板子都长不出来，连接效率很低。。
找不到问题所在。