为什么连接这么难呢？
做了很久的连接了，几乎总是失败。无论是用普通的T4酶连接，还是将片段PCR后用专门的PCR产物连接试剂盒连接；无论是用哪个公司的酶连接，总是连接不上，为什么呢？现在严重怀疑是自己的技术问题……
连接后转化大肠杆菌，阳性对照每次都可以长出来，就是自己的连接样品不长，无论是新配制的抗性平板，还是配制了大约一个月的抗性平板，都不长……所以我怀疑是自己的连接出了问题，不知道猜想对不对？求各位大侠赐教。
难道是连接后需要纯化吗？但是请教了别的实验室的人，都说一般不需要纯化，都是直接转化的呀~涂板时也注意将涂布器凉了再涂的呀，应该不会将细菌高温杀死了啊？也没敢涂的时间太久啊，大概每块板就两三分钟吧，也应该不会导致细菌死亡啊？……哪里的问题呢？
连接时的操作都需要注意些什么呢？跪求各位指点啊！跪求……
我这只大菜鸟……
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首先PCR后跑电泳检测，全部上样，割胶回收。然后连接。
连接我做了两组（均为TaKaRa产品）：
1、 10xT4连接Buffer 1ul
pMD 18 T 载体 1ul
T4 DNA 连接酶 1ul
割胶回收PCR产物 7ul
2、 pMD 18 T 载体 1ul
割胶回收PCR产物 4ul
Solution 1 5ul
两者均为16摄氏度连接过夜，我还怕温度不准，放在了PCR仪里，取出来时看了时间，14个小时多，按理说肯定该连接好了。但是转化大肠杆菌后不长。
PCR我也是重新做的，就是想着用新鲜的PCR产物，载体是问别人借的，因为实验室正好用完了，但是别人每次都可以连接成功的……所以我就搞不懂是哪里的问题了，难道是我的酶有问题？
[ Last edited by 西瓜 on 2011-6-8 at 16:05 ]
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京公网安备 11010802022153号
阳性对照ok的话，那连接出问题的可能比较大啦。建议你把连接步骤详细说下。
我们实验室的话，如果连接屡次不成，会直接重新做连接底物，PCR重做，载体也重新切。PCR产物用试剂盒纯化，载体酶切之后胶回收纯化，不过也有人上述两者都只是乙醇沉淀纯化，做得也很好。连接产物我们从来不纯化呢。
用Takara的试剂盒做连接，然后放到PCR仪里面，时间久点
还有就是要是你连续连接超过三次都不行的话最好考虑换酶，PCR和酶切的酶
我的也是连接了好久一直连接不上，但是最近换了PCR的酶之后很顺利，连着连接上两个，呵呵
pMD18-T vector ligation system
pMD18-T 1uL
DNA template 4uL
Solution I 5uL
Total 10uL
将纯化的PCR产物与T载体连接重组，16℃保温3～4h后，全量（10uL）转化至150uL的E.coli DH5α的感受态细胞。
(1) 将10μL连接液移入含200μL感受态细胞的1.5mL dorf管中，冰浴30-60min。
(2) 42℃水浴热激90sec后，立即再冰浴5min。
(3) 加入300μL LB液体培养基，37℃ 220 rpm培养1-2h。
(4) 吸100μL菌液涂布含Amp/ X-Gal/ IPTG平板培养基的LB固体培养基平板， 37℃ 培养16－24h。
保证PCR产物或感受态细胞的质量即可。
这个我怀疑是感受态细胞的质量或是转化步骤存在很大问题~
，
顺便提一下
pMD18-T vector载体的链接效率很低，如果总是做不出来，可以用promega的T easy载体。
我一直用takara的PMD19-T，一般没出现过什么问题，在4度连接过夜，如果片段稍长，就多连接一天...
是不是你回收的目的基因不纯，有杂质会影响连接反应。