当前位置: 首页 > 微生物 >丝状真菌基因敲除,转化子假阳性过多

丝状真菌基因敲除,转化子假阳性过多

作者 汤锐5211314
来源: 小木虫 750 15 举报帖子
+关注

大家好。本人最近在做一种丝状真菌基因敲除实验。用的是PEG介导转化的方法,实验过程与步骤没有什么大的问题,也可以拿到转化子,但是在后期验证的过程中发现转化子都是假阳性。目的基因未能被敲掉,但是潮霉素基因已被整和到真菌的基因组上。在后期的实验中,调整了原生质体的浓度,转化片段的浓度,均未获得正确的转化子。
    请各位大神提供一下指导意见或者改进措施能够减少假阳性的概率,提高基因敲除效率。(原生质体的制备与转化没问题,可以获得转化子,但是转化子均是假阳性,目的基因和潮霉素基因都存在) 返回小木虫查看更多

今日热帖
  • 精华评论
  • 汤锐5211314

    引用回帖:
    2楼: Originally posted by 199006287956 at 2018-01-29 20:16:41

    什么情况?你知道我的问题怎么解决吗?

  • A00696

    最近在做丝状真菌原生质体转化,由于孢子形状椭圆形近似圆形,所以打算用菌丝做。将孢子直接放到LB摇瓶中摇 ,瓶子放了0.1mm的玻璃珠,成大小不一的菌丝球,对球未做任何处理直接酶解 时用的是 0.1%Driselase +0.05% lysing enzymes ,渗透压保护剂是0.7M氯化钾和10nM的氯化钙,30度,180rpm 酶解3h,三层滤纸1层Miracloth过滤后,滤液离心未有原生质体沉淀。         考虑菌丝球太大不易酶解,故把10的6次方每ml的孢子涂玻璃纸,收集菌丝酶解。每个平板10ml的酶解液, 四种酶组合:0.5%Driselase+0.3% lysing enzymes+2%snailase 和0.5% 纤维素酶,渗透压保护剂同上,30度,220rpm 酶解3-4h 后镜检未发现断裂的的菌丝,更不用说心心盼盼的原生质体了。感觉从外观上看酶解前后未有变化。        不知道做不出原生质体的问题出在哪?摇成的菌丝球或者从玻璃板上收集到的菌丝需要进一步破碎?用均质仪?才能进行酶解?        求做过丝状真菌原生质体转化的大神指点一番 不胜感激!
    你能指导下吗 我连原生质体都拿不到,

  • dawiye

    做的哪一种丝状真菌?

  • 汤锐5211314

    引用回帖:
    4楼: Originally posted by A00696 at 2018-01-31 09:44:16
    最近在做丝状真菌原生质体转化,由于孢子形状椭圆形近似圆形,所以打算用菌丝做。将孢子直接放到LB摇瓶中摇 ,瓶子放了0.1mm的玻璃珠,成大小不一的菌丝球,对球未做任何处理直接酶解 时用的是 0.1%Driselase +0.05 ...

    分生孢子摇培培养基是用的LB吗?看你写到的是丝状真菌,我不太了解你的真菌,我做过的几种丝状真菌都没有放在LB中摇培的,有的是在YEPD或者PDB液体培养基中。直接收集分生孢子后,加入到摇培培养基中,培养温度以及转速对于后期的菌丝酶解处理也有一定的影响。


    不建议直接酶解从玻璃纸收集的菌丝,这样的菌丝过老,不容易酶解。这个方法我之前用过,不太靠谱。

  • Zhenhui_Ren

    可以分享一下原生质体制备的详细过程吗?

  • 555weiteng

    我也是挑的都是假阳性,你挑了多少株?我挑了1000株没有敲掉的。

猜你喜欢
应助之星
下载小木虫APP
与700万科研达人随时交流
  • 二维码
  • IOS
  • 安卓