5'粘性末端的片段加A尾,做TA克隆
最近拿有一个天然质粒,用三种酶随机切,切了之后跑胶确定被酶切成了不同的片段。之后要做TA克隆,想给片段加A尾。因为我用的酶切出来之后都是带有5'突出末端,所以想知道,要是加A尾的话,是不是直接用TAQ酶加A尾就行了呢?
因为taq酶具有5'-3'的聚合酶活性,可以将5'粘性末端补平,最后在3'端加A尾,不知道这样行不行?
另外,想问一问,在做TA克隆转化步骤中,酶切灭活后,加A尾时需要纯化酶切片段吗?加了A尾之后也需要纯化片段吗? 返回小木虫查看更多
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首先,Taq酶可以加尾,其次,加尾后用PCR纯化试剂盒纯化就行,不用切胶回收
1. taq酶可以补平加A
2, 需要纯化,主要是去掉taqbuffer,换成连接酶buffer
你好,请问,我酶切后跑胶确认片段切开了,80℃灭活5min,这个体系需要纯化了再加TAQ酶吗?还是说灭活体系直接加TAQ酶对加A尾没有影响呢?
你好,请问,我酶切后跑胶确认片段切开了,80℃灭活5min,这个体系需要纯化了再加TAQ酶吗?直接加TAQ酶对加A尾有影响吗?
另外,加A尾这个步骤还需要94℃2min来预变性吗?还是只用72℃ 10min就好呢?
酶切后你要分离出自己要的片段吧?而且buffer不同,所以最好纯化。直接加taq可能没活性
不需要变形,72˚C10min-30min
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