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pLysS表达T7溶菌酶,为什么不会溶解宿主菌?

作者 zsygxh
来源: 小木虫 500 10 举报帖子
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pLysS质粒表达T7溶菌酶,能降低背景蛋白表达,那么为什么不会溶解宿主菌呢?按理说即使它是胞内表达,但培养过程中多少总会有细菌裂解,酶就会释放到培养基里,那不就会产生连锁反应了吗?但实际上为什么能正常生长表达呢?想不明白,求解惑。 返回小木虫查看更多

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  • 精华评论
  • snoopytbw

    表达后的蛋白处于包涵体包裹状态吧,酶活性受到了抑制。我觉得是这样。欢迎指正!

  • zsygxh

    引用回帖:
    2楼: Originally posted by snoopytbw at 2018-01-12 09:00:09
    表达后的蛋白处于包涵体包裹状态吧,酶活性受到了抑制。我觉得是这样。欢迎指正!

    谢谢,但我倒不这么认为,因为使用含pLysS质粒感受态的优点是表达的T7溶菌酶可以结合T7 RNA聚合酶并抑制其转录活性,从而降低目的基因的背景表达,但又不干扰IPTG诱导目的蛋白的表达,所以我觉得T7溶菌酶应该是正确折叠发挥功能的。如果处于包涵体状态,那么设计这种自带pLysS质粒的感受态本身就没有意义了,但事实上现在有很多这种商业化的感受态,且对毒蛋白表达效果貌似不错。

  • snoopytbw

    包涵体并不是说蛋白构象都错误折叠,你可以考虑为,外层错误 内层正确,隔离在囊泡类结构里面,使得其不能接触到细胞壁,或干扰肽聚糖合成

  • 小冀-

    我觉得首先你应该验证一下,你的酶到底有没有成功表达,这是一个最基本的前提~还有就是想要抑制质粒的表达需要很少的量就可以,但是裂解细胞应该会对溶菌酶的浓度有一定的要求,即使有细胞裂解,但是培养体系过大、表达量太低的话还是没用

  • zsygxh

    引用回帖:
    6楼: Originally posted by 小冀- at 2018-01-15 10:06:08
    我觉得首先你应该验证一下,你的酶到底有没有成功表达,这是一个最基本的前提~还有就是想要抑制质粒的表达需要很少的量就可以,但是裂解细胞应该会对溶菌酶的浓度有一定的要求,即使有细胞裂解,但是培养体系过大、 ...

    首先谢谢。pLysS并不是我的质粒,它是商业化感受态自带的一个质粒,比如BL21(DE3)pLysS、Rosetta-gami(DE3)pLysS、Tuner(DE3)plyss、Origami(DE3)plyss……我前面提到的是它的作用,所以应该不存在表达不成功的情况。浓度低倒有可能,但我又在想,如果是发酵罐高密度表达,生长过程中裂解的菌应该会有很多,酶本身不消耗,那么应该很容易形成连锁反应,但……。其实,我是好奇这个质粒表达的T7溶菌酶是否有什么特殊修饰,以及具体的作用机理

  • 小冀-

    引用回帖:
    7楼: Originally posted by zsygxh at 2018-01-15 23:14:40
    首先谢谢。pLysS并不是我的质粒,它是商业化感受态自带的一个质粒,比如BL21(DE3)pLysS、Rosetta-gami(DE3)pLysS、Tuner(DE3)plyss、Origami(DE3)plyss……我前面提到的是它的作用,所以应该不存在表达不成功的情况 ...

    你说的是能够表达T7启动子的菌吧~这里面虽然引入了噬菌体RNA聚合酶结合位点的吧,它的作用主要用于表达蛋白,理论上是不足以理解细菌的,在小试的规模上蛋白表达和菌株生长都很好,所以用的比较多,比如BL21(DE3);但是在大体系发酵过程中会存在一定的问题,发生细菌自溶的几率比较大,这是目前的通病,但是原因并不是很清楚,有人推测是因为引入的噬菌体原件导致菌体自溶,和噬菌体本身有关,可能和培养环境有关~你的推测就是溶菌酶,但是在小试情况下又解释不通了

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