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透射电镜标本制备方法

由于电镜电子束穿透能力的限制，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。

在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步骤。

一 取材的基本要求

组织从生物活体取下以后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部各种酶的作用，出现细胞自溶现象。此外，还可能由于污染，微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏。因此，为了使细胞结构尽可能保持生前状态，必须做到快、小、准、冷：

(1)．动作迅速，组织从活体取下后应在最短时间内 (争取在1分钟内) 投入2.5%戊二醛固定液。
(2)．所取组织的体积要小，一般不超过1mm×1mm×1mm。也可将组织修成1mm×1mm×2mm大小长条形。因为固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。
(3)．机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。
(4)．操作最好在低温(0℃～4℃)下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶。
(5)．取材部位要准确。

取材方法：将取出的组织放在洁净的蜡版上，滴一滴预冷的固定液，用两片新的、锋利的刀片成“拉锯式”将组织切下并修小，然后用牙签或镊子将组织块移至盛有冷的固定液的小瓶中。如果组织带有较多的血液和组织液，应先用固定液洗几遍，然后再切成小块固定。
二．固定

固定的目的是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结构保持生活状态，并且牢固地固定在它们原来所在的位置上。固定的方法有物理的和化学的两大类。物理的方法系采用冰冻、干燥等手段来保持细胞结构；化学的方法是用一定的化学试剂来固定细胞结构。现通常使用化学方法对组织或细胞进行固定。

常用固定剂有:

1、四氧化锇 (osmium tetroxide，)是一种强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，因而对于细胞结构中的蛋白质成分有良好的固定作用。它还能与不饱和脂肪酸反应使脂肪得以固定。此外，四氧化锇还能固定脂蛋白，使生物膜结构的主要成分磷脂蛋白稳定。它还能与变性DNA以及核蛋白反应，但不能固定天然DNA、RNA及糖原。四氧化锇固定剂有强烈的电子染色作用，用它固定的样品图象反差较好。锇固定的时间一般为1-2小时。

2．戊二醛 (glutaraldehyde C5H8O2)，戊二醛的优点是对糖原、糖蛋白、微管、内质网和细胞基质等有较好的固定作用，对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强，还能保存某些酶的活力，长时间的固定(几周甚至1～2个月)不会使组织变脆。

缺点是不能保存脂肪，没有电子染色作用，对细胞膜的显示较差。

组织块固定常规采用戊二醛—锇酸双重固定法。分预固定和后固定，中间用磷酸缓冲液漂洗。前固定用2.5%戊二醛固定2小时以上、后固定用1%锇酸固定液固定1～2小时，pH7.3～7.4。

固定完毕，用缓冲液漂洗20分钟后进行脱水。
三．脱水

为了保证包埋介质完全渗入组织内部，必须事先将组织内的水分驱除干净，即用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水，常用的脱水剂是乙醇和丙酮。急骤的脱水会引起细胞的收缩，因此，脱水应剃度进行：70% 丙酮15分钟，80% 丙酮15分钟，90%丙酮15分钟，100%丙酮１0分钟(二次)。游离细胞可适当缩短脱水时间。过度脱水不仅引起更多物质的抽提，而且会使样品发脆，造成切片困难。

四．浸透和包埋

(一) 浸透

浸透就是利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水剂，这种包埋剂在单体状态时(聚合前)为液体，能够渗入组织内，当加入某些催化剂，并经加温后，能聚合成固体，以便进行超薄切片。目前常用的包埋剂是环氧树脂(epoxy resin)。环氧树脂是一类高分子聚合物，它的分子中含有两种反应基团，即环氧基和羟基。当加入酸酐类时，树脂分子中的羟基能与酸酐结合，形成分子间的横桥连接，这种起横桥式连接作用的交联剂叫做硬化剂，它们参与交联反应，并被吸收到树脂链中。常用的硬化剂有十二烷基琥珀酸酐(或叫十二碳烯基丁二酸酐，简称DDSA)、甲基内次甲基邻苯二甲酸酐(或叫六甲酸酐，简称MNA)及顺丁烯二酸酐等。当加入胺类时，就引起末端环氧基相连，形成首尾相接的长链状聚合物。这种促进末端相接的交联剂叫做催化剂或加速剂。常用的加速剂有2,4,6－三(二甲氨基甲基苯酚)(简称DMP(30)、二乙基苯胺及乙二胺等。为了改善包埋块的切割性能，某些环氧树脂包埋剂配方中还加有增塑剂，使包埋块具有适当的韧性。常用的增塑剂为邻苯二甲酸二丁酯(简称DBP)。

包埋操作： 常规将组织块包埋在多孔橡胶包埋模板中，然后置烤箱烘干，在45℃(12小时)、60℃(36小时)烤箱内加温，即可聚合硬化，形成包埋块。

包埋操作中应注意以下几点：

(1)所有试剂要防潮，最好存放在干燥器中；

(2)所用器皿应烘干；

(3)配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀；

(4)包埋时动作要轻巧，防止产生气泡；

(5)皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎；

(6)盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干净。
五．超薄切片

(一) 超薄切片前的准备工作

1．修块

一般用手工对包埋块进行修整。将包埋块夹在特制的夹持器上，放在解剖显微镜下，用锋利的刀片先削去表面的包埋剂，露出组织，然后在组织的四周以和水平面成45度的角度削去包埋剂，修成锥体形。

2．半薄切片定位

利用超薄切片机切厚度为1μm-10μm的切片，称厚片或半薄切片。将切下的片子用镊子或小毛刷转移到干净的事先滴有蒸馏水的载玻片上，加温，使切片展平，干燥后经甲苯胺蓝染色，光学显微镜观察定位。

半薄切片进行光学显微镜观察的目的：(1) 定位：通过光学显微镜观察，确定所要观察的范围，然后保留要用电镜观察的部分，修去其余部分。(2)便于对同一组织的同一部位进行光学显微镜和电镜的对比观察。半薄切片定位以后，要对包埋块作进一步的修整。通常将块的顶端修成金字塔形，顶面修成梯形或长方形(最好是梯形)，每边的长度为0.2mm～0.3mm。

3．制刀

超薄切片使用的刀有两种：一种是玻璃刀，另一种是钻石刀。由于玻璃刀价格便宜，使用者较多。制刀用的玻璃为硬质玻璃，厚度为5mm～6.5mm。

玻璃刀用制刀机制作。制好玻璃刀后，要围绕刀口制作一只水槽，以便使超薄切片漂浮在水面上。水槽有树胶水槽和胶布水槽两种。树胶水槽有固定的形状，可反复使用。胶布水槽是临时用胶布或专用塑料条制作的。装好水槽后，用熔化的石蜡封固接口，防止漏水。

4．载网和支持膜

4.1 载网

电镜中使用的载网有铜网、不锈钢网、镍网等，一般常用铜网。载网为圆形，直径3mm。网孔的形状有圆形、方形、单孔形等。网孔的数目不等，有100、200、300目等多种规格，可根据需要进行选择。

4.2 支持膜的制备

挑选并清洗好载网之后，要在载网上覆盖一层薄膜，这层薄膜称支持膜，厚度为10nm～20nm。对支持膜的要求是透明无结构，并能承受电子束的轰击。常用的支持膜有火棉胶膜及聚乙烯醇缩甲醛膜(formvar膜)，一般采用后者。

(二) 超薄切片

超薄切片需用超薄切片机进行。根据推进原理不同，将超薄切片机分为两大类：一类是机械推进式切片机，用微动螺旋和微动杠杆来提供微小推进；另一类是热胀冷缩式切片机，利用金属杆热胀或冷缩时产生的微小长度变化来提供推进。

超薄切片的步骤包括：(1)安装包埋块；(2)安装玻璃刀；(3)调节刀与组织块的距离；(4)调节水槽液面高度与灯光位置；(5)调节加热电流及切片速度，切片；(6)将切片捞在有支持膜的载网上。
六．超薄切片的染色

未经染色的超薄切片，反差很弱。因此，要进行染色处理，以增强样品的反差。一般是用重金属盐与组织细胞中某些成分结合或被组织吸附来达到染色的目的。重金属的原子对电子束形成散射，从而提高图象的反差。常用的染色剂有醋酸铀和柠檬酸铅。染色方法有两种：

1．组织块染色

在脱水至70%乙醇或丙酮时，将组织块放在用70%乙醇或丙酮配制的饱和醋酸铀溶液中，染色时间2小时以上，或在冰箱中过夜。

2．切片染色

预先取一个清洁的培养皿，将石蜡溶解制作成蜡板，然后滴数滴染液于蜡板上，用镊子夹住载网的边缘，把贴有切片的一面朝下，使载网浮在液滴上，盖上培养皿，染色10～20分钟。载网从染液中取出后，必须尽快用蒸馏水清洗干净。在染色过程中，铅染液容易与空气中的二氧化碳结合形成碳酸铅颗粒，而污染切片。因此，在保存和使用染液时，要尽量减少与空气的接触。为防止铅沉淀污染，可在培养皿内放置氢氧化钠丸，以吸收空气中的二氧化碳。

七、电镜观察、拍片、记录等。

做好观察记录，选好范围拍片，准确记录底片号码及相应内容，然后在电脑中备案。

说明：
主要电镜制样技术
1.超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备
2.负染色技术（Negative staining） 染色背景，衬托出样品的精细结构        
3.冰冻蚀刻技术（Freeze etching） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。
4.电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。

电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（Structural Biology）（主要研究生物大分子空间结构及其相互关系）的主要实验手段。

超薄切片技术步骤过程图：



超薄切片技术
超薄切片技术
超薄切片是透射电镜生物样品制备方法中最基本、最重要的常规制样技术，主要应用于生物组织和细胞器的研究。操作过程复杂，制备繁琐，环环相扣，技术性强。

    成功的超薄切片必须达到如下几点：
（1）切片平整，没有刀痕、皱褶、震颤及染色剂的污染；
（2）切片厚度一般为70nm（700Å）左右，较薄的切片分辨力较高，但反差较弱，而较厚的切片反差虽好，但分辨力稍差；
（3）细胞的超微结构得到良好的保存；
（4）切片的包埋介质耐受电子束的照射；
（5）切片染色后，具有良好的反差并可获得清晰的图像。
1.1 取材
    为了尽可能使生物材料保持生活状态，必须在做好实验前的试材、器材和试剂等各项准备工作后依据“快、准、轻、小（0.5-2mm2） ”的原则，进行取材。
1.2  固定
      固定是指用物理方法和化学方法迅速杀死细胞的过程。物理固定法指用冷冻、高温和蒸煮等方法迅速杀死细胞组织的过程，在电镜样品制备中主要用于特殊目的。而化学固定法应用更为普遍，它是采用一定的化学试剂来完成固定的全过程。这种化学试剂则称之为“固定剂”，它能和细胞内的大分子物质，发生化学结合形成交联，使蛋白成分得以凝固稳定，也能保存糖类和脂肪，使其保持生活时的状态和位置，从而保存好细胞的精细结构。
      影响固定效果的因素：固定液的酸碱度（pH值）、渗透压、固定液的温度和时间，以及缓冲液的选择等因素，都会对固定效果产生直接影响。
1.3 漂洗  0.1M磷酸缓冲液（PBS)，PH7.2
1.4 脱水
30%乙醇或丙酮——50%乙醇或丙酮 ——70%乙醇或丙酮 —— 90%乙醇或丙酮 ——100%乙醇或丙酮2次，每次每级 10～30min
1.5 渗透、包埋
脱水剂：包埋剂    动物材料（小时）    植物材料（小时）    体外培养细胞（小时）
3：1    1    2    0.5
1：1    1    4    0.5-1
1：3    1    4    0.5
纯包埋剂    半天或过夜
    半天或过夜
超薄切片是将固化的包埋块在超薄切片机上切为薄片的过程（厚度约为50nm-100nm），它是整个制样程序的中心环节。
1.7.1 载网
载网是承载超薄切片的圆形铜网，镍网、不锈钢网或银丝网。网孔的形状有圆形、方形单孔形、狭缝形等，网孔的数目有50～400目多种规格。
1.7.2 制备支持膜
      在干净的铜网表面制备一层透明而无结构的支持膜，以便承载切片样品。
（1）Formvar膜
（2）火棉胶膜
1.7.3 修整包埋块
        将包埋块的尖端修成适当的梯形，使其中的组织露于包埋块尖端。
1.7.4 切片刀
（1）玻璃刀
制作简便，价格低廉，但刀刃不耐用，而且不能切割硬质材料。
（2）金刚刀  
  金钢刀又称钻石刀，刀锋锐利，刀口在室温下不氧化，质地坚硬，经久耐用，但价格昂贵。
1.8  染色
      常用双染色法    醋酸铀—柠檬酸铅双染色法，是当前增强切片反差的常规染色技术。醋酸铀主要显示细胞核与结缔组织，柠檬酸铅主要用以提高细胞质内各种成分的反差。
1.9 电镜观察

[ Last edited by wanders on 2009-10-20 at 15:24 ]

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