【求助】纤维素酶纯化后活性问题
各位虫友,最近我在做纤维素酶纯化实验,克隆了几个基因(celB,bglS,bglC),然后将片段连到pET30(His-Tag),再转入E.coli BL21(DE3)原核表达的。已经得到电泳纯的条带了,浓缩之后蛋白浓度也达到了2mg/ml+,今天我用各种底物测试其酶活性(DNS法),可是样品和对照OD值几乎一样啊!!为什么会这样?各位虫友有没有遇到过这种情况的?或者帮忙给点解释和建议?难道是融合表达之后蛋白活性发生变化?
PS:我今天测试的纤维素酶是celB(外切酶)和bglS(地衣聚糖酶),底物分别试了CMC-Na,微晶纤维素,木聚糖,具体操作是:
200ul酶液(200+ng)+200ul 1%底物 反应10min 加500ulDNS煮沸显色的?不知是不是底物选择问题?还是说反应时间少了?我看文献上条件和我类似,也是反应10min。所以现在我纠结的很啊~~马上研三了~~急的一米哇~!还望各位虫友不吝赐教~先谢过了!
[ Last edited by 一个小术士 on 2012-6-13 at 08:37 ] 返回小木虫查看更多
今日热帖
我有5个疑问:
1、酶液和底物都是200微升,那么pH值是多少?有可能在该pH值下酶的活性受到抑制。
2、DNS必须在碱性环境下才能被还原,测定酶活力的体系是400微升,DNS才500微升,DNS里的氢氧化钠含量能不能保证碱性?
3、沸水浴5分钟,不知道你是多久。
4、这些酶如果是从真核生物来的,那么没有活性也可以理解了,折叠可能有问题。
5、还是折叠的问题,假如是形成了包涵体,用尿素变性之后再梯度减少尿素浓度来重折叠,那么可能蛋白质能溶解,但活性不一定保留完整,至于保留多少,看运气。
感谢您的回复,
1.底物是溶于PH7.0 的PBS,酶纯化时也是PBS-咪唑洗脱的,就是超滤的时候加水洗脱,PH应该变化不大;
2.这个反应体系我是参照文献上的,而且之前测定过粗酶酶活,可以显色;
3.我也是沸水5MIN;
4.酶基因是从芽孢杆菌扩增的,也是原核生物;
5.没有形成包涵体,在上清液中。
那就麻烦了,我找不出原因,只能看看别人有什么想法。
恩,还是谢谢啦 ~!
你的对照是怎么处理的呢?
酶液+DNS终止+底物,煮沸5min
刚刚看了您之前回复别人的帖子,我有点启发,想向您再请教一下:
1.我之前忘记交待了,我转化之后挑选转化子只做了PCR和酶切验证,并没有做平板筛选,所以即使我SDS-PAGE能得到相应纯化的条带,也不能说明得到阳性克隆?
2.如果我还需要进一步用平板筛选我该选择什么?可以往LB加入CMC和IPTG再用刚果红染色么?因为当初克隆的基因分析过是没有信号肽的(或者被我切除了。。。),所以担心会不会产生透明圈
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