你说的怎么分都分不开，是都用过什么方法啊？仅改变了磷酸和乙腈的比例，还是其他流动相也尝试过了呢？如果酸化过强，对柱子的分离效果也有影响的。我们一般用的是0.1%的磷酸水。

楼主的意思应该是调整了比例也没分开，可以尝试不同ph值或更换其它缓冲盐试试

如果那两个连在一起的峰是同分异构体，lz就杯具了。可是试试加单标，用来确定是否为同分异构体，如果是，建议考虑别的定量和定性的方法，RP-HPLC很难分开同分异构体。如果不是同分异构体，建议考虑调整流动相pH值。

谢谢各位高手的指点，我换过流动相的比例，0.5%磷酸参照的是文献，还没有变过，可以去尝试一下，PH原来用三乙胺调的3.8，后来调到3.5，分离效果没有改善，就没有调了，应该不是同分异构体，不知各位还可否指点一下，而且同样的方法一个月以前做的比现在做的分离效果要好，

生物碱本来就很难分离，楼主提到的三种生物碱要想较好的分离度和峰型最好尝试采用极性C18来梯度分离。至于重复性原因是楼主采用的添加剂为磷酸，建议采用盐来分离这样会更好一些

调流动相比例，或者换流动相试试应该能解决的