【求助/交流】求助!大家帮我看一下我的PCR体系有什么问题没?
我最近在做一种未知菌的16SRDNA的PCR,一直没做出来,大家帮我看一下到底是哪里出现了问题?
PCR体系:
模板 5uL
上游引物(2.5uM) 5uL Tm 57.8
下游引物(2.5uM) 5uL Tm61.9
Mgcl2(50mM) 3 uL
10*PCR buffer 5uL
dNTP (2.5mM ) 1uL
Taq酶(2u/ul) 1uL
ddH2O 25uL
反应程序:
95(5m)
95(1m)
53(1m)
73(2m)
72(10m)
30个循环.
结果P不出来,并且我也不知道P出来的条带应该是多少bp?大家帮我分析分析吧,只有10个金币全送上.
他们给我的引物合成书上的TM值是:
上游引物 Tm 57.8
下游引物 Tm61.9
但是我根据TM=4(G+C)+2(A+T)引物长都为20BP,算出来的
上游引物 Tm 60
下游引物 Tm64
所以我的程序退火温度应该是多少呢?53会不会太低了?
[ Last edited by wwsw38 on 2010-4-23 at 21:56 ] 返回小木虫查看更多
怎么没人帮我看看啊,我在在线等啊
退火温度为什么用53?太低了吧?调到60度试试吧
30循环应该只是第二阶段
你的模板质量如何?引物设计有没有问题?这两个才是PCR最关键的因素。可以尝试将循环数增加一些。
体系中模板量一般不用体积来衡量。10-100ng质粒就够了,如果是gDNA可以多一些。
扩增不出来,首先要考虑模板是否降解,这个可以用其它引物来验证;
试着把MgCl2降一些,设计几个浓度梯度。
同意楼上的,引物和模板最关键,引物设计的好,温度跨度很大也能P出来
引物也有点少,5-8ul就应该够了
dNTP肯定少了,4ul
Mg离子,3-4ul
总的来说你这个体系就dNTP有问题,看一下酶的说明书
扩不出来有可能是引物的问题,不过你至少应该做个温度梯度
你不知道产物多大,太奇怪了,谁给你的引物,怎么设计的,