原核表达载体构建老不成功,求助!
本人构水稻基因的原核表达载体(PET-28a),胶回收后老是连不成功,以前也没再意就成功了,但这次老不行;现在想请教一下各位虫友你们在构载体时体系是怎么样的,我的是目的片段:载体=6:1.5 1ul T4酶 1ul buffer 0.5u水。TAKARA的ligation kit 也用过,也不行。希望大家给点意见!!!
下面是我回收后的电泳图,是8ul上样!
图片1.jpg 返回小木虫查看更多
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本人构水稻基因的原核表达载体(PET-28a),胶回收后老是连不成功,以前也没再意就成功了,但这次老不行;现在想请教一下各位虫友你们在构载体时体系是怎么样的,我的是目的片段:载体=6:1.5 1ul T4酶 1ul buffer 0.5u水。TAKARA的ligation kit 也用过,也不行。希望大家给点意见!!!
下面是我回收后的电泳图,是8ul上样!
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我20微升的体系加 buffer2微升,楼主可以看看连接酶的说明书
检没检测过片段里是否有突变位点?
你这图上哪个是载体哪个是片段?怎么有3个大小不同的条带?而且都太淡了!
最后两个是载体,前一个是没有切过的对照,是啊,浓度确实很低
,
没有,这个该怎么检测??
谢谢,我在看看
没有酶切的载体应该主要是超螺旋吧?超螺旋质粒应该比线性化的质粒跑得快才对?你的marker也用的不合适,建议挑选一个可以分析质粒大小的marker。
关于双酶切的具体定量设计,建议参考double digestion designer,小木虫上可以找到