虚心请教关于平—粘末端的连接问题
用sal I和sca I这两个酶处理过目的片段和载体，纯化回收后连接，转化后板没有菌落，不知道哪里出现了问题。
这两个酶，处理后一个产生粘性末端，一个产生平末端，有人说这样的按正常的连接体系条件就可以，但我一直没有成功。
我在做的是构建全长，最后的这个1800bp的片段怎么也加不进去。
关于目的片段：是PCR产物，纯化处理过，测序正确。
关于载体：确定有这两个酶切位点，并且唯一。
关于T4连接酶：分别用过TAKARA、NEB、以及Fermentas。
关于连接体系：调整过多次比例。
关于反应温度：试过16度过夜、22度4小时等等。
关于抗性：这个还是不会弄错的。
关于感受态：自己做的，商品化的都用过
[ Last edited by thendlee on 2012-3-12 at 19:34 ]
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京公网安备 11010802022153号
那请问sal I 和sac I 在目地DNA片段上也是唯一的吗？还有你确定你把载体切开了吗？确定下带了吗？如果载体和片段什么问题都没有，建议使用多种感受态做，比如TOP10，EPI300，EPI400，JIM108，JT115都可以尝试一下，还有就是在37度恒温培养不行就换30度。
嗯 片段上也是唯一的 载体我是分别单酶切的 这个应该没问题
我再试试其他感受态吧 谢谢
，
我也想知道
楼主你好!
是这样的, 一般平末端连接效率很低的, 更何况1.8kb已经是比较大的片段了!
有几个建议:
1.根据载体的分子量, 严格控制载体: 目的片段的mol=1:1, 16度连接过夜
2.切开的载体去磷酸化,防止自体连接
3. 先连接到T载体上, 再选用T载体和你的目的载体上都有而目的片段上没有的粘性末端内切酶同时酶切T和目的载体, 连接 或者 选用目的载体上别的内切酶; 重新换引物PCR目的片段
重点在DNA的质量和片段比例
你的1800bp的片段确实比较大，首先你要确保你们实验室的感受态效果非常好，其次你要最好先把1800bp的片段胶回收的干干净净，再连T载体，然后酶切回收，小片段浓度高一点。你最好用超级感受态化转。
根据你的描述 sal I 和sac I 应该在目地片段的首和尾，你的片段测序正确的，酶切pcr产物如果不好做，我建议在片段两端加上重组臂，重新扩pcr，先装入puc57或puc18常用载体。等测序对了。在用加了重组臂的首尾扩质粒。载体用sal 1切 直接做重组。