聚丙烯酰胺凝胶电泳
现在在做聚丙烯酰胺电泳,胶浓度为15%,电压100v,电流30mA左右。运行后15min,loadingbuffer都不动,这是怎么回事?现在实验都不能进行了。
我确定我的loadingbuffer质量是没问题的。我觉得我可能是细节上出了问题,求高手指点! 返回小木虫查看更多
今日热帖
现在在做聚丙烯酰胺电泳,胶浓度为15%,电压100v,电流30mA左右。运行后15min,loadingbuffer都不动,这是怎么回事?现在实验都不能进行了。
我确定我的loadingbuffer质量是没问题的。我觉得我可能是细节上出了问题,求高手指点! 返回小木虫查看更多
是不是胶浓度有问题。浓缩胶浓度一般为3%-5%,分离胶浓度根据待分离样品的情况选择适当的分离胶浓度,通常使用的15%的聚丙烯酰胺凝胶的分离范围是104~105,即分子量小于104的蛋白质可以不受孔径的阻碍而通过凝胶,而分子量大于105的蛋白质则难以通过凝胶孔径,这两种情况的蛋白质都不能得到分离。所以如果要分离较大的蛋白质,需要使用低浓度如10%或7.5%的凝胶(孔径较大);而对于分离较小的蛋白质,使用的较高浓度凝胶(孔径较小)可以得到更好的分离效果
,
是不是胶浓度有问题。浓缩胶浓度一般为3%-5%,分离胶浓度根据待分离样品的情况选择适当的分离胶浓度,通常使用的15%的聚丙烯酰胺凝胶的分离范围是104~105,即分子量小于104的蛋白质可以不受孔径的阻碍而通过凝胶,而分子量大于105的蛋白质则难以通过凝胶孔径,这两种情况的蛋白质都不能得到分离。所以如果要分离较大的蛋白质,需要使用低浓度如10%或7.5%的凝胶(孔径较大);而对于分离较小的蛋白质,使用的较高浓度凝胶(孔径较小)可以得到更好的分离效果。
不好意思我没有说完全,我用的是非变性,连续的凝胶系统。分离的物质是十几个碱基的寡核苷酸。我觉得即使是凝胶浓度大了点,跑15分钟,不能连buffer都不带动的啊。
这事儿我干过,后来重新配了凝胶再跑就没问题了,当时也没找出什么原因,期待高手回答呵呵
重新做块胶试试吧
我也做非变性的电泳,我的溴酚蓝到底了,可是我的蛋白还在上样孔附近,悲剧啊
十几个碱基的PAGE,一般用19:1(ARC:BIS-ARC)的8-10%胶,15%的胶太大,是不是你自己想的?同时缓冲液也要注意,缓冲液没有达到浓度,离子浓度不够,也跑不下来。建议按照 分子克隆手册 重来
我也有过类似的情况……
楼主确定是一动不动吗?还是动的极慢?
按照楼主说法,15min如果有移动一点点,那楼主看看电流是多少,我用的也是连续凝胶系统,120v,正常一块胶电流在23~25mA,2块胶在43mA左右……如果低于这个值,除了楼上各位建议的配胶问题外,可能还有电泳槽安装问题,外液是否过高,胶板是否未夹紧导致短路等等……
PS:我用的是伯乐的预制胶,有时候底下的密封胶带忘了撕也会跑不动……如果楼主自己配的就没这个问题了……