【求助/交流】PCR的问题
扩一个基因，1314bp，GC含量约有63%。
25微升体系如下：引物 0.5/0.5
10乘buffer 2.5
dNTP 0.5
Taq酶 0.5
cDNA（模板）1
DMSO 1
ddH2O 18.5
扩增设计：95℃ 5min
95℃ 45s
58、63℃ 45s
72℃ 1min30s
72℃ 10min
4℃ hold
28个循环
扩了三次没有扩出来
GC含量高，一会准备换个GC buffer，但是师姐说那个没有什么用处。
请教各位大侠~~~
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京公网安备 11010802022153号
1.退火温度，引物量，酶量等做几个梯度，优化一下。
2.模板在提纯一些
3.换换PCR仪
还不出的话，可能是引物设计的不好吧。你加DMSO就是说你的东西不好P，在好好弄弄引物吧。
63%的GC还不算太高
撤掉DMSO看看，DMSO不一定都是增强剂，有可能抑制PCR反应
另外，换个活力好的酶吧
我查了文献说ＤＭＳＯ在６％——１３％时效果最好，低于４％或者高于２０％就不行了，２５微升体系１微升的ＤＭＳＯ，差不多是４％，那么应该再增加ＤＭＳＯ呀。。。
嗯，我再用高保真酶扩一下，谢谢
，
GC buffer还是有用的
我P过GC 72%的，只有加了GC buffer才行
Primer5设计的引物温度是65摄氏度，已经降了很多了。。。片段起始区GC含量就很高，没办法额
换个高保真酶试试。