【求助/交流】PCR反应体系请教!
最近在扩增基因,用如下程序,扩好多次都没结果,只有引物2聚体,大家帮看下反应程序有无问题。
水: 12.2微升
10*buffer: 2微升
DNTP:2微升
引物F(5PM): 0.8微升
引物R(5PM): 0.8微升
Taq: 0.2微升
CDNA模板:2微升
早上来老板说酶加少了,应该加2微升,引物应该提高到4微升。排队等PCR仪中,哪位高人看下,体系还有什么需要优化的? 返回小木虫查看更多
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我们是25微升的体系,但是酶只加0.5微升啊,不知道你们是怎样的,扩不出来可以调节一下其他的量
应该把各种组分的浓度加上吧 我们实验室用的是宝生物的Taq酶 25ul的体系加0.125ul的Taq酶
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[quote]Originally posted by hclcarl at 2010-12-27 10:13:22:
应该把各种组分的浓度加上吧 我们实验室用的是宝生物的Taq酶 25ul的体系加0.125ul的Taq酶 [/quote
我们用的酶是老板的同学实验室自己做的,所以浓度也不太清楚!
把各成分浓度标上
一般扩不出条带 很大原因是模板和引物
如果是通用引物 模板是否讲解
如果是自己设计的 建议重新设计引物
引物是根据已知的基因序列设计的,因为要克隆CDS序列,所以就在编码区两端设计引物,前加酶切位点和保护碱基。共9个基因设计了引物,55度退火扩增,一条带也没出来,请看一下引物浓度低吗?我扩出来只有引物2聚体,是否说明引物够用? 我扩的长度9个基因都在1000-1500bp之间
另外我们的酶是自己做的,别人用来扩拟南芥400-600bp的片段可以扩出来,20微升体系加0.2微升,你看我这个酶是不是加的少了?
我们也是25微升体系
酶只加0.2微升 宝生物的taq酶