这是第一次PCR结果，感觉条带不，体系都是按照TaKara 的50ul体系来的。模板，推荐的2.5ng，一般我都用2.5 ul.(反转录前，总RNA稀释了10倍)


就以PCR产物为模板，进行二次PCR。模板量有2.5变为4ul，引物混合物也加倍了，结果还是不好。（第二张图）



后来查看网上需把PCR产物稀释后做模板，，也咨询了师兄，兼并引物条带弱，加大模板或增加循环。综合起来，我就做了如下处理：

（TaKara 50ul推荐体系，buffer 5；Mg2+，3； dNTP 4，模板 2.5ng；引物混合物（20um）2；taq，0.25，剩下的就是加H2O。）

                             原    液      稀释50倍  稀释100倍        原  液

模板量                     2.5  1       2.5     4     4      4          1    1

引物量 （10um）      4     4        8       8     8       8         8    8



以前最多跑35循环，这次加大到45。退火温度50。



结果见第3张图，效果还不如第2张好。



请教高手，这种问题怎么解决。这样的条带能不能做胶回收，T/A克隆。看网上有人说，条带弱，多跑几块胶，一起胶回收，加大量，做T/A克隆，我这个能不能这样做。谢谢！

[ Last edited by andywang6137 on 2010-9-7 at 21:57 ] 返回小木虫查看更多