设计引物遇到难题
本人扩增的序列为946bp，21-608为CDS，以下为基因序列；
1 agaagaaccc gacaccagaa atggagaaga aattgtttgg tatcgcttta ctcttaacta
61 ctgtagcctc agttttggcc gccgatacaa acgccccaat atgtctttgt gacgagccag
121 gagttctagg acggactcag atcgtgacga cggagattaa agataagatc gagaaagctg
181 tcgaagctgt tgcacaagag agtggtgtat caggaagagg attttctata ttttctcatc
241 atcctgtgtt cagggaatgt ggcaaatacg agtgtcgaac cgtgaggcct gaacacagcc
301 gttgctataa ctttcccccg tttattcatt tcaagtcaga atgccctgtt tcaactcgag
361 actgtgagcc agtatttggt tatacggtag caggagagtt tagggttatt gtacaggctc
421 caagggctgg gtttagacag tgtgtgtggc aacataagtg tcgattcggt agtaacagct
481 gtggttataa tgggaggtgt actcagcaga ggtcagtggt tcgtttggtg acctacaact
541 tggagaaaga cggtttcttg tgtgaaagct tccgaacatg ctgtggttgt ccttgtcgta
601 gtttttaagc ctaactcatg ggttttagtt cttaagtcta actcattaag actaaattgt
661 taagccaaac tcatgagttt agacacaagg attattcagt actatctttg caaatattac
721 tttttgattg ttagtttcga caaattaacg atgcttgttc aaattttaaa accttctaaa
781 ctacagaact aacattcagt aaaatataat ttgatttcgt aattacaata agaacgtaac
841 atgtattgtt atcaccttct ccatccaatc attttttata ctctgtatga ataaaatact
901 gtatggaatg tactttgtac aataaagtta aatatatatc tatgcc
用pp5设计引物，设计条件上游引物在1-20bp内，下游引物在609-946bp内。引物长度在18-21内均试过，得到的上下游引物Tm值相差非常大，上下游引物的GC含量相差也很大，条件很不好，不懂的应该怎么改条件，按照网上的说法改了条件还是不好，求大神赐教！！！
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可以长一点，保证两条引物的TM值相差在5度以内
谢谢您的回复啊。本人是新手，这个一整段基因序列长度就是946bp，我是想扩增出来表达蛋白质的。请问如何长一点呢？不懂
，
如果已经有CDS。
为什么还需要引物呢？
直接P全长就好了。
上下游直接取，只要Tm相近即可，不用管长度
你上游引物在1一20bp选？那基本上是没得选呀。你的实验目的是什么？