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以提取的基因组为模板,使用PrimerSTAR酶对目的基因进行PCR无果,求助各位大神

筛选到一株含有目的酶的菌株,使用NCBI查找到目的酶的基因,以提取的基因组为模板,使用PrimerSTAR酶对目的基因进行PCR均未果。期间重新设计过引物,进行过梯度PCR但都没有结果,且每次跑胶结果都特别干净,没有任何条带。实验新手一枚,现在请问各位大神有没有遇到过这种情况?是不是可以用Taq酶进行一下PCR,但我是要PCR获得目的基因送测序,怕Taq酶保真性不高有突变。希望大家可以给出一些建议,一些我可以继续的尝试,谢谢大家了!

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基因组用纯水稀释10或100倍试试,基因组中残留酚氯仿影响pcr

primerstar扩增不出来,是因为它具有将你的引物或者模板讲解的 可能性,而普通的Taq酶没有, 所以Taq酶能扩出来的,primerstar不一定能扩出来,而热启动Taq聚合酶扩增性能很好,不会出现primerstar的 情况而且大于普通酶的 灵敏度和特异性,值得 一试。如果扩增片段大于15kb的话,推荐长扩增聚合酶,下游实验对精确度要求很高的话,建议使用 具有 保真性的高保真酶。

2楼: Originally posted by flhua at 2017-10-09 21:09:06
基因组用纯水稀释10或100倍试试,基因组中残留酚氯仿影响pcr
好的,谢谢建议,明天试试

3楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-10-09 21:17:05
primerstar扩增不出来,是因为它具有将你的引物或者模板讲解的 可能性,而普通的Taq酶没有, 所以Taq酶能扩出来的,primerstar不一定能扩出来,而热启动Taq聚合酶扩增性能很好,不会出现primerstar的 情况而且大于普 ...
谢谢,请问primerstar可以将引物或是模板降解还是第一次听说,可以具体解释一下吗,万分感谢;会试一试用taq酶进行PCR,日后有问题还请多多指教,谢谢!:hand:,

先用taq酶扩增试试,primerStar对模板要求比较高……

我也有一段目的基因,用基因组作为模板怎么都行不通,换了好多引物都不行。相同基因其他位点都p出来了。
楼主最后解决了没?

2楼: Originally posted by flhua at 2017-10-09 21:09:06
基因组用纯水稀释10或100倍试试,基因组中残留酚氯仿影响pcr
这问题我也遇到过,稀释之后确实扩出来了

7楼: Originally posted by egexig at 2017-10-10 10:04:04
我也有一段目的基因,用基因组作为模板怎么都行不通,换了好多引物都不行。相同基因其他位点都p出来了。
楼主最后解决了没?
还没解决呢,现在正在一点点尝试,咨询大家的建议:hand:

是不是基因组上没有你要的基因,基因组有问题,基因片段短的话用菌液为模版都能P出来

2楼: Originally posted by flhua at 2017-10-09 21:09:06
基因组用纯水稀释10或100倍试试,基因组中残留酚氯仿影响pcr
我提的基因组浓度为147ng/ul,50ul的体系我之前加的1ul,这样浓度会偏高吗?还是我提的基因组浓度太低?

8楼: Originally posted by luckydog52 at 2017-10-10 12:06:33
这问题我也遇到过,稀释之后确实扩出来了
...
请问你提的基因组浓度有多少啊?我的基因组浓度147ng/ul

一般我都稀释成终浓度10-50,25ul体系加1ul,或者把题好基因组烘干,再用纯水溶解做模版,或者用培养好菌液做个菌液pcr扩增一个小片段试试,确认目标基因在基因组上

谢谢大家!今天把基因组稀释了10倍和100倍,用Ex Taq酶和primer STAR酶均可以P出条带,万里长征总算迈出一小步了,谢谢大家的指导。

7楼: Originally posted by egexig at 2017-10-10 10:04:04
我也有一段目的基因,用基因组作为模板怎么都行不通,换了好多引物都不行。相同基因其他位点都p出来了。
楼主最后解决了没?
既然知道了目的基因序列,你就多提一点基因组,可以试试直接双酶切以后得到你的序列,然后纯化一下,重新pcr,或者双酶切后克隆至载体上,在pcr:hand:

12楼: Originally posted by 长大的小鱼93 at 2017-10-10 14:56:22
请问你提的基因组浓度有多少啊?我的基因组浓度147ng/ul...
忘了,这个不是模板浓度的事。是你提DNA时候的残余杂志对你的酶的影响。

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