大家好，我第一次设计了引物，前几天引物刚合成回来，很是激动，因为不知道自己设计的怎么样。这几天刚做了实验验证了一下，结果令人失望，因为我做了两个平行的EP管，其中一管电泳的结果是有目的条带但很浅很浅（如下图黑框中所圈中的，请见上传图片），（我上样加的是5ul ），在maker的最前面即100bp的位置有很亮的条带，应该是引物二聚体
我的一个老师一看电泳结果，说可能得重新设计引物，说实话，我一听这个心里就很难受了，因为我当初设计时真的很认真，我用的是primer5.0设计的引物，设计完后，就有一项令人不满，即Cross dimer那的△G=-7.7，Tm均是53度多点，上下相差0.6度，GC%一个是55.6%，另一个是52.6%。评分也均是100（我没有刻意追求评分）。（请见上传图片）
若老师让我重新设计引物，我真是找不到更好的了，因为大家都知道，设计引物时很难找到那种一点瑕疵都没有的（即在primer5.0下边一个都不”红“的）引物。以前我们用过两对引物（是我们没来科室前老师设计的），这两对引物也均有cross dimer ,而且其中有一对的△G的绝对值比7.7还高，扩增的效果也不错，最后经过摸索条件还有引物二聚体，但是目的条带很亮。
所以我就是想说，我设计的这对引物是不是没有什么问题，是不是经过摸索条件把引物二聚体去掉或减少呢？
对了，我们做得是RT-PCR,用的是一步法，但设程序时有逆转录和PCR扩增两个部分，我所用的引物0.5ul （100ulM),体系是28ul 。我的引物浓度是不是过大(我们以前扩增成功的55.5ul体系中用的引物也是1ul，100ulM）？一个PCR体系中引物的浓度该如何确定呢？我除了从引物浓度方面考虑，还应从哪几方面考虑？该如何调整才能有效去除引物二聚体增亮目的条带呢？
我的老师的建议是分两步走，即在原来体系的基础上什么都不变，只是在程序上只进行到反转录这一步，然后就电泳，看是否有目的产物,若有目的产物再做梯度PCR摸索退火温度。.我不知道为何这样做？这样就不会形成引物二聚体了吗？原来一步法的体系只做反转录那一步合适吗？
我是一个新手，我真的不太懂这方面的知识，也正在学习中，希望各位专家帮帮忙！谢谢！如果有什么看不懂的咱们可在QQ58297217上交流（单纯为了学习，非诚勿扰），我很诚恳的向各位专家请教！


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