【求助/交流】RT-real time pcr问题
我是新手 请高手不吝赐教
我是做β微管蛋白基因的相对基因表达差异,以β-ACTIN为内参基因,在前面的RT-PCR中我得到的rna是否可以不用电泳鉴定就直接可以用于后面的cDNA转录,因为电泳槽经常跑DNA,我担心rna鉴定时被降解
在荧光定量pcr之前我要用得到的cDNA分别以β微管蛋白基因引物和β-ACTIN内参基因引物来进行pcr扩增,以检测cDNA是否搞出来了,如果我摸索出了他们的较佳的pcr反应条件那我以后是否就可以省略这步直接在荧光定量pcr上来进行相对定量pcr检测
谢谢 返回小木虫查看更多
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RNA降解是因为RNA酶的存在,跟你的电泳槽跑DNA无关。
你检测CDNA时只跑actin即可; 摸索出RT-PCTR条件后,可直接省略此步骤。
其实,你验证的仅是你逆转的CDNA质量如何。
谢这位高手。你的意思是必须进行rna电泳鉴定。那我进行rna电泳鉴定时电泳槽可以不用DEPC水洗,可以不用新胶和新缓冲液吗?我看到好像有人用甲醛的凝胶电泳,而且电泳槽还要用酸还是碱洗(我好像有点忘了),过氧水洗,还得高温烘干,好像太费事了
摸索出rt-pcr条件后我省略此步普通pcr那我的cDNA怎么保证质量可以呢
谢谢
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呵呵,你理解错了,我的意思是不用进行RNA鉴定。我们提的次数多了,直接逆转CDNA后跑RT-PCR。就看你提RNA的水平能不能过关了
谢谢你的指点,你的意思是rna电泳鉴定可以省略,但是得到的每个cDNA都要以actin引物来进行普通pcr鉴定,没有问题再进行荧光定量pcr
呵呵,也不是。只要你能确保你提的RNA质量好,不必用普通PCR来验证,直接跑RT-PCR即可。所以,你需要的就是多联系RNA提取技术
谢谢你的指点