免疫组化中的问题
大家好,想问下做小鼠脑的冰冻切片时,甲醛固定后蔗糖梯度脱水时,配制蔗糖时感觉30%的蔗糖配制后溶液有点温,可能是蔗糖溶解时放热,想问下用不用把蔗糖溶液放到四度冰箱降温再用,如果直接用的话,会不会增加免疫组化的非特异性染色? 返回小木虫查看更多
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大家好,想问下做小鼠脑的冰冻切片时,甲醛固定后蔗糖梯度脱水时,配制蔗糖时感觉30%的蔗糖配制后溶液有点温,可能是蔗糖溶解时放热,想问下用不用把蔗糖溶液放到四度冰箱降温再用,如果直接用的话,会不会增加免疫组化的非特异性染色? 返回小木虫查看更多
从我们做的经验来看,不必进行上述处理。冰冻切片后,晾干,然后用丙酮固定10-15min即可。如果没有时间直接做下去,还可以用塑料袋包好切片盒,置于4度冰箱内,在这样的温度与环境下,抗原不会消失。在做免疫组化时,取出,不必进行枸椽酸缓冲液高温抗原修改复;有时也不必进行tritonX-100进行细胞打孔,做免疫组化后没有出现非特异性染色。
冰冻切片后,晾干,然后用丙酮固定10-15min即可。在做免疫组化时,取出,不要进行枸椽酸缓冲液高温抗原修改复,加适当浓度的tritonX-100进行细胞打孔,做免疫组化后没有出现非特异性染色。
对脑的冰冻切片,我们通常用4%的多聚甲醛配30%蔗糖脱水,而多聚甲醛通常是保存在4度或室温,没有楼主所说的现象。如果是做贴片,那切完后用37°烤片1-2h然后进行下一步实验;如果是漂片(我们常用漂片),则将切片收集于4%多聚甲醛中备用。丙酮或甲醇处理会使切片容易卷曲;至于triton或tween处理与否则视需要而定,对绝大多数抗原是不需要所谓的“打孔”的,对于染不出来的、难染的抗体才考虑增加膜通透性。
造成非特异染色的原因很多。
我想向您请教,在切片前已经固定过了,切的片再放到PFA里有什么作用
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这也算后固定吧,切片捞片会损伤片子,后固定一下会好点