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原核表达载体构建老不成功，求助！

作者 sjjsy7: 来源: 小木虫 1000 20 举报帖子

本人构水稻基因的原核表达载体（PET-28a），胶回收后老是连不成功，以前也没再意就成功了，但这次老不行;现在想请教一下各位虫友你们在构载体时体系是怎么样的，我的是目的片段：载体=6:1.5 1ul T4酶 1ul buffer 0.5u水。TAKARA的ligation kit 也用过，也不行。希望大家给点意见！！！
下面是我回收后的电泳图，是8ul上样！

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精华评论

ysn5048

我20微升的体系加 buffer2微升，楼主可以看看连接酶的说明书
张宏宇123

检没检测过片段里是否有突变位点？
尚慕寒

你这图上哪个是载体哪个是片段？怎么有3个大小不同的条带？而且都太淡了！
sjjsy7

引用回帖:
4楼: Originally posted by 尚慕寒 at 2012-09-17 20:55:55
你这图上哪个是载体哪个是片段？怎么有3个大小不同的条带？而且都太淡了！

最后两个是载体，前一个是没有切过的对照，是啊，浓度确实很低
，
sjjsy7

引用回帖:
3楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-09-17 15:16:07
检没检测过片段里是否有突变位点？

没有，这个该怎么检测？？
sjjsy7

引用回帖:
2楼: Originally posted by ysn5048 at 2012-09-17 12:54:40
我20微升的体系加 buffer2微升，楼主可以看看连接酶的说明书

谢谢，我在看看
酶切专家

没有酶切的载体应该主要是超螺旋吧？超螺旋质粒应该比线性化的质粒跑得快才对？你的marker也用的不合适，建议挑选一个可以分析质粒大小的marker。
关于双酶切的具体定量设计，建议参考double digestion designer，小木虫上可以找到