RT-PCR老出不来，是RNA质量问题吗？
本人最近在做RT-PCR，提取的RNA 5s条带总是很亮，是不是降解了啊？还有就是用之前在DNA上P出来的引物在RNA上Ｐ，结果出来的结果很奇怪，上下游引物互换，扩增出来的片段测序为１８ｓ 核糖体ＲＮＡ的部分片段，不是我要的目的片段；换引物重做，又在别人的文献里找了个内参基因，但我不知道这个内参基因是什么，结果我的目的片段没出来，内参基因出来了，这是不是就说明我的ＲＮＡ质量没问题啊？本人愚见，如果内参也是扩核糖体ＲＮＡ的话，会不会是总ＲＮＡ中ｍＲＮＡ的质量很少或降解了，所以以ｒＲＮＡ为模板就能扩出来，以ｍRNA为模板就扩不出来啊？第一张图是我提的RNA，第二张图中很亮的带就是内参基因扩出来的。请各位大侠帮我分析一下啊？
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自己先顶一下啊，急等高人指教！
5S的亮度已经远远超过了28s和18s，说明降解狠严重，至于内参，它的片段太小，无法说明整个RNA和反转录的质量，最好能上传一下你的cDNA图片吧，这样应该可以说明问题
我用的是一步法RT-ＰＣＲ试剂盒，反转录和ＰＣＲ是一起做的，没有单独反转录成ｃＤＮＡ，我想问一下，您说的cDNA是DNA和RNA的杂合链吗？还是双链DNA啊？
还想请教一个问题，我老师说虽然5s很亮，但是上面两条带还挺完整的，不影响我后面实验的，可是我觉得不是这样的啊？请求您的指导？还有关于内参的问题，为什么片段小不能说明问题呢？
一步法啊，那你是看不到cDNA的，你们老师说的我不好评说，也许你们老师是对的，呵呵，干嘛不自己去测一个od，一切都解决了。
cDNA的话是单链的，也可以说是反转录的第一链。
内参的话，因为一般片段都很小，很容易被覆盖，所以，鄙人认为不具参考价值，尤其你做长片段PCR的话。只能说明你操作没问题，不能说明你的RNA质量，
谢谢你的建议，我做的目的片段也很小，才300多点，我想还是重换引物试试吧！关于测OD，我们实验室没有条件，没有那种能加很少样的比色皿，所以我一般就只能跑胶看rna质量了
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我的理解，cDNA当然是单链DNA，因为就算在反转录过程中存有杂合链，也很快在RNA酶作用下被分解。转录成CDNA的目的就是为了易于保存嘛，