其实个人觉得楼主说的：以上条件、试剂连接大肠杆菌载体（pcDNA3、pMD18-T、pTA2和pGEX4T-1）都未出现问题；给这些载体克隆基因没有问题并不见得给你的那个载体克隆也没有问题嘛，这不问题出现了吗？

克隆一个基因其实个人觉得关键在于连接和感受态细胞。。。按照你上面所述，连接体系应该也不会出现什么问题，连接时间可以稍微短一些，7小时---10小时试试。。。

另外抗生素有没有问题呢？浓度会不会太大了？

你的载体和基因酶切是否完全？如果酶切不完全，也会影响你后期的连接的。。。

可以变换体系再试试。。。

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Originally posted by 天使托 at 2011-05-24 19:54:46:
其实个人觉得楼主说的：以上条件、试剂连接大肠杆菌载体（pcDNA3、pMD18-T、pTA2和pGEX4T-1）都未出现问题；给这些载体克隆基因没有问题并不见得给你的那个载体克隆也没有问题嘛，这不问题出现了吗？

克隆一个 ...

为了避免酶切不完全，我也用以前连上基因的载体（目的基因300bp）做模板酶切，切出片段后回收载体部分做连接，但出现前面相同现象。
如果说抗生素浓度过大，但平皿上仍有菌落长出，但却提不出质粒。红霉素降到150ug/ml则会出现更多杂菌。

引用回帖:

Originally posted by 天使托 at 2011-05-24 19:54:46:
其实个人觉得楼主说的：以上条件、试剂连接大肠杆菌载体（pcDNA3、pMD18-T、pTA2和pGEX4T-1）都未出现问题；给这些载体克隆基因没有问题并不见得给你的那个载体克隆也没有问题嘛，这不问题出现了吗？

克隆一个 ...

怎么，刚回的帖子没有了？？？
为了避免酶切不完全，也曾用连上目的基因的重组载体酶切，切下条带后，回收载体部分连接信的目的基因，结果依然同前。
红霉素浓度曾降低到150ug/ml，但杂菌太多，所以放弃，即使现在用200ug/ml也有菌落长出，很少，但不含质粒。
连接时间，说实话，按说明书从30min~48小时都做过，没什么区别。

引用回帖:

Originally posted by caojie107 at 2011-05-26 18:47:03:
同学，问题可能出在感受态上吧，还有不知道你们实验室的质粒pMG36e 可不可以交换或者购买？

http://www.yrgene.com/index.php? ... p;id=5&Itemid=5

请问楼主，你在提取pMG36e空载的时候顺利么？我最近也在提取，载体在大肠杆菌DH5a内，加了抗生素可以生长，但是提取质粒电泳后就是看不见条带，不知道什么情况，我增加了菌液量也是不行，请问楼主在提取质粒的时候需要注意些什么？谢谢

引用回帖:

Originally posted by wangzhou79 at 2011-06-08 10:52:40:
请问楼主，你在提取pMG36e空载的时候顺利么？我最近也在提取，载体在大肠杆菌DH5a内，加了抗生素可以生长，但是提取质粒电泳后就是看不见条带，不知道什么情况，我增加了菌液量也是不行，请问楼主在提取质粒的时候 ...

用阳性质粒转化大肠杆菌后，提取质粒没有什么问题。只是在连接产物转化后，经常碰到你所说的现象。解决方式是先做菌落PCR确定含有质粒后在对其实施提取质粒的操作，培养时间16-19h，一般用小提试剂盒提取（9ml菌液处理后，过一个柱子，用30-60ul溶液洗脱），常规碱裂解提取质粒，往往200ml起提，最后溶在50ulTER里。估计你用的是碱裂解法，菌液量也不够，pMG36e拷贝数不高，菌液少了很难提出来，试试试剂盒
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