最近，坛子里很多的朋友经常问16S rDNA扩增不出来或者测序测不出来可能是什么问题。今天上午没啥实验，码个帖子，谈谈我的想法。

1. 什么是16S rRNA

16S rRNA是原核细胞核糖体构成的基本原件。原核细胞的核糖体沉降系数约为70S，相对分子质量为2.5x103 kDa,由50S和30S两个亚基组成; 典型的原核生物核糖体是由50S大亚基和30S小亚基组成的。在完整的核糖体中，rRNA约占2/3, 蛋白质约为1/3。50S大亚基含有两种RNA分子，相对分子质量大的rRNA的沉降系数为23S，相对分子质量小的rRNA为5S。30S小亚基含有一个16S的rRNA分子。

2. 16S rRNA的华丽外衣

每套华丽外衣的下面都有一些辛勤纺织的织者，16S rRNA也不例外。如果说在上世纪七十年代之前16S rRNA还是默默无闻的灰姑娘的话，那么Carl Woese就是让灰姑娘熠熠生辉的那个王子。1977年，他根据16S rRNA的系统进化关系图，提出了著名的三域学说，提出了古菌这一说法。16S rRNA系统进化分析也成为现今最为经典的微生物分类方法之一。微生物分子生态的研究者也应该牢记Carl Woese这个名字，我们现今最为流行的文库构建、DGGE、FISH等技术无不是以16S rRNA为基础的。Carl Woese也在2003年的时候获得了生态学中的诺贝尔奖—Crafoord Prize。

3.为什么是16S rRNA

rRNA 参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何细胞型生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的分子钟。在 16S rRNA 分子中，不但含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。16S rRNA 的相对分子量大小适中，约1540bp，含有足够多的信息以便于亲缘关系研究， 5S太短，而23S 的序列相对于当时的测序技术显得有点过长。

4. 为什么你的16S rDNA测序测不出来

16S rDNA在微生物的基因组中有多少个拷贝，每个拷贝都相同么，拷贝在基因组中的分散度有多大，大家想过这样的问题没有。如果没有想过这些问题，没有看过这方面的文献，那么你16S rDNA测序不顺利的时候，你一定会问为啥别人都那么容易自己这么纠结。你会反复送样去测序，甚至怀疑你染菌了。其实都不是的。甚至很多搞微生物分类和分子生态的人都没有注意到过这方面的问题。因为16S rRNA的二级结构太保守了，它和蛋白质构成的三级结构也太保守了，执行的功能甚至没有丝毫差别，以至于我们也长久的忽略了它们也是有多样性的。有兴趣的可以看看下面这两篇文献，我就不详细介绍了，没有兴趣的能够知道这个多样性的事实就已经达到了我的初衷。
Diversity of 16S rRNA Genes within Individual Prokaryotic Genomes
Diversity of 23S rRNA Genes within Individual Prokaryotic Genomes

5. 当你的16S rDNA测序测不出来

我相信，坛子里面的很多朋友只是在碰到问题的时候上来发问，然后迅速解决实验上的问题。当初我也是这样的，无可厚非。那么在扩增不出来的时候或者全是套峰的时候应该怎么迅速解决这样的问题呢？我给以下两点建议：

a, 扩增不出来的问题：在你的基因组DNA没有什么重大污染的前提条件下 (比如多糖太多，酚类很多)，16S rDNA扩增应该是很好做的。当你偶然碰到一个扩不出来的，重复无果的情况下，果断换引物吧，这不是你的操作问题，从27&1492换成另一对或者将其中的一条换掉。

b, 套封的问题：送样好几次，公司返回来的信息都是套峰或者信号弱，而你的PCR产物的确是很浓的。这也不是你的错，你也不要抱怨测序公司，因为这也不是他们的错。停止送样，连T载体送吧。这个时候，你扩增的是一个16S rDNA的混合物，一些位点可能是多变的，甚至长度都是不一样的，差个几十个碱基在胶上是看不出来的。

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[ Last edited by brightfuture01 on 2011-1-11 at 11:55 ] 返回小木虫查看更多