贴壁细胞传代培养相关技术
（一）器材设备
培养瓶，吸管，橡皮头，离心管，广口瓶，滤器（大小），针管，冻存管，高压消毒器，培养箱，无菌工作台，CO2气罐，相差倒置显微镜，4℃冰箱，20℃冰箱，pH调节仪

（二）试剂配制
1）培养基的配制

使用前，加入小牛血清，使其浓度为10%


2）PBS配制（1000ml）
NaCl 8.5g
KCl 0.2g
Na2HPO4•12H2O  2.85g
KH2PO4 0.27g
上述试剂称量后加入800ml双蒸水中，搅拌至完全溶解，调节pH=7.2，用1000ml量筒定容，过滤除菌，4℃保存

3）胰酶配制
配制PBS液体100ml，0.25g胰酶（粉剂），EDTA 0.02g 加入其中，搅拌至完全溶解（约4小时，期间放入4℃冰箱一次，全程冰袋保护），调节pH=7.5，然后放入冰箱4℃过夜，次日过滤（或次日再调pH值过滤）

4）抗生素配制
80万单位青霉素+4ml PBS
100万单位链霉素+5ml PBS后取出4ml加入上述青霉素液中，充分混合之后，8ml液体分装，-20℃保存，每99ml培养基中加入青链霉素混合液0.1ml，其终浓度青霉素100u/ml；链霉素100ug/ml

5）冻存液配制
DSMO加入小牛血清，DSMO浓度为10%；注意，DSMO要避光保存。
（三）操作步骤


准备工作
试剂的准备（见试剂配制部分）
设备及器材的准备
确保操作台洁净，所用物品经过高压或者其他方式消毒

细胞复苏
1.        将冻存的细胞取出后迅速放入37℃水浴中，并不时摇动，在一分钟内使其完全融化
2.        将细胞吸出放入有培养基的离心管中中，用滴管轻轻吹打混匀，800转/min，5分钟离心；弃去上清液，加入培养基，混匀再离心一次，弃液，加入4~5ml 培养基，混匀，移入培养瓶中

细胞换液
1.        用旧液体轻轻冲洗培养瓶底，然后用滴管吸尽旧液（弃去）
2.        加入PBS1~2ml，轻轻摇晃，然后用滴管吸尽旧液（弃去）
3.        如果细胞液比较脏，可以重复步骤2
4.        加入新培养基，轻轻摇匀，放入培养箱继续培养

细胞传代
1.        用旧液体轻轻冲洗培养瓶底，然后用滴管吸尽旧液（弃去）
2.        加入PBS1~2ml，轻轻摇晃，然后用滴管吸尽旧液（弃去）
3.        加入约1~1.5ml胰酶，室温或培养箱中放置4~5分钟，直到所有贴壁细胞消化下来为止【判断方法：倒置相差显微镜观察，细胞变圆时就可以终止消化】
4.        加入约1ml培养基（含有小牛血清）终止消化
5.        用滴管吹洗一次，移入离心管, 800转/min，5分钟离心
6.        加入培养基，吹打分散细胞，再根据分传细胞瓶数补加一定量的含血清的培养基，制成细胞悬液；分装至2~3个培养瓶中
7.        放入培养箱进行培养

细胞计数
1.        准备好显微镜、载玻片、盖玻片、血细胞计数板、吸管等仪器设备
2.        按照“细胞传代”中讲述的方法制成细胞悬液
3.        将细胞悬液取出若干，滴入血细胞计数板，注意不要有气泡进入
4.        加样后静置2~3min后观察，数四角大格内的细胞总数。计数时应按照一定的路径，以免遗漏或重复。细胞压线时计上不计下，计左不计右，计数2~3次，取平均值
5.        细胞密度 = 四大格中细胞总数÷4 ×104 = 细胞数/ml悬液

细胞冻存
1.        重复“细胞传代”中的消化细胞的步骤，将细胞消化下来，转移至离心管800转/min，5分钟离心，弃液
2.        沉淀中加入冻存液，轻吹制成悬液
3.        分转到冻存管内，每个1~1.5ml
4.        将冻存管口封严
5.        贴上标签，注明冻存时间、细胞种类及代数
6.        按下列顺序降温，并最终冻存：室温→ 4℃ 20min → -20℃ 30min →-70℃冻存 返回小木虫查看更多