微生物代谢组学抽提的问题,希望做代谢组方面的人给予帮助,谢谢!!!
本人做微生物代谢组学,现在抽提胞内代谢物用的是液氮反复冻融法进行抽提,具体是取一定量发酵液后,离心,倒上清,之后用0.85%NaCl清洗一次菌体,离心,倒上清,然后用与发酵液等量的80%甲醇抽提,先置于液氮中冻住,再在冰上解冻,解冻后涡旋5min,这个流程重复3次,之后离心,弃菌体,将甲醇冻干后用相应试剂复溶,用GC-MS进行检测。
目前的问题是这个方法有两个问题想请教大家一下:1、抽提效果有时候很好,物质比较多,峰形也好,但有时候峰非常少,或者除了内标之外完全没有峰;2、经常出现有大量甘油的情况,而我的这个菌是不可能产生这么多甘油的,不知道这些甘油从哪里来,冻干之后肉眼都可见。
现在基本能排除生长问题,菌生长状况都正常,OD也比较高;也基本能排除衍生化问题和机器问题,因为内标一直都很稳定,衍生化试剂也是即开即用,实验过程严格无水。
所以考虑可能是抽提的问题,想问一下大家做抽提的时候也像我一样实验结果经常不稳定吗?还是我抽提的步骤哪里有问题?另外抽提的时候偶尔会有大量甘油,又是从哪里来的?
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感觉楼主的前处理方法就很有问题啊,是按文献里来的吗?
代谢组做的是有机酸还是蛋白质啊,如果是有机酸的话,用甲醇单抽,显然效果极差的。你看看文献看,我们这用的是甲醇/乙腈/丙酮,配比自己根据样品性质调整,有时候丙酮可以不加,但是感觉乙腈是必须加的。然后反复冻融法目的是啥?如果代谢组的话,目标应该是小分子多肽和有机酸的话,这些东西显然对反复冻融极其敏感啊。建议换方法,可以用化学法直接抽提。而且有机酸和多肽的抽提方法是不同的,依据文献吧。做组学分析,前处理是极其关键的
非常感谢您的解答,有几个问题想追问一下,我做代谢组目标物是有机酸、氨基酸,加上糖类和脂肪酸,物质希望尽可能的多,但是重点室有机酸和氨基酸,我的抽提方法是根据Methodological approaches to help unravel the intracellular metabolome of Bacillus subtilis这篇文献的方法来的,反复冻融的目的是尽可能使细胞破碎完全,抽提剂之前我试过甲醇、乙腈、水,效果和纯甲醇差不多,不过也是反复冻融,您说的小分子多肽和有机酸对反复冻融敏感给我的帮助很大,这个之前真的没考虑过,谢谢!不知道您说的化学抽提法具体流程是怎样的呢?方便给一个大致的流程我参考一下吗?谢谢!不胜感激
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你可以用很简单的方法,比如甲醇破壁法,也可以用低频超声破碎,超声对大分子蛋白质的影响较大,而对小分子几乎没有影响。
然后,我觉得你要查下,你所用的菌种的有机酸提取方法,可以查下,对应菌株的脂肪酸分析相关文献,我估计差别不会太大,效果也不会差异过大。芽孢杆菌通常都比较难破壁,估计破壁方式都很暴力。化学抽提法,我用的很简单,就是等体积分数的甲醇,乙腈,乙醇,直接抽,有条件可以用分布式抽提法,就是用两种配比的抽提液,分别抽提,有同事说效果好一点,然后以前学校老师教过有个办法是用乙酸乙酯抽提,具体我没做过,据说效果也不错。
谢谢补充
谢谢!太感谢了!