用xbarI单酶切，去磷酸化后，构建好了载体，测序没问题，但单酶切验证就是切不下来，是什么原因？请各位大神赐教 返回小木虫查看更多
1、XbaI可能受dam甲基化影响, TCTAG(6m)ATC无法切开 2、NdeI+XbaI双切不会有什么问题，但是Nde连接时需要使用平滑末端连接条件，不知你双切后的载体做没有作脱磷 3、为什么不先用你目的基因的PCR引物（包含完整序列）先做菌落PCR，能P出来肯定你插入的片断是完整的。 4、不知道你的引物是和载体哪个部分互补的，1-3k的正反两个通用引物就能测通了埃�
既然测序都没问题了，就别纠结了，继续往下做就可以
XbaI会受dam甲基化的影响，如果酶切位点后面紧跟着TC，序列TCTAG(6m)ATC不能被识别，结果是不能被切开。之前我的也是这样切不开，之后换了个酶切位点，切出来的大小是对的。楼主可以试着换一下酶切位点。
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1、XbaI可能受dam甲基化影响, TCTAG(6m)ATC无法切开
2、NdeI+XbaI双切不会有什么问题，但是Nde连接时需要使用平滑末端连接条件，不知你双切后的载体做没有作脱磷
3、为什么不先用你目的基因的PCR引物（包含完整序列）先做菌落PCR，能P出来肯定你插入的片断是完整的。
4、不知道你的引物是和载体哪个部分互补的，1-3k的正反两个通用引物就能测通了埃�
既然测序都没问题了，就别纠结了，继续往下做就可以
XbaI会受dam甲基化的影响，如果酶切位点后面紧跟着TC，序列TCTAG(6m)ATC不能被识别，结果是不能被切开。之前我的也是这样切不开，之后换了个酶切位点，切出来的大小是对的。楼主可以试着换一下酶切位点。