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新手上路，急急急，求助土壤细菌PCR扩增条件~~~~

作者 xiaowo1127: 来源: 小木虫 900 18 举报帖子

我想请教一下各位大侠，我是研究土壤微生物多样性的，需要用PCR扩增细菌V3区的基因，但是经过很长时间的摸索，也不理想（条带扩增不出来，很多时候是引物形成了二聚体，而不是需要的目的基因），请各位大侠指点一下如何能摸索到最佳条件，如有最佳条件请借我借鉴一下~~~拜托啦！！！返回小木虫查看更多

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精华评论

kiruwa

跑一个positive control,估计是你DNA提取不理想. 细菌16S rRNA是最好扩增的,退火温度多少?
weebug

调温度看下，annealing temp. 通常低于TM五度。若pcr有gradient功能，annea1ing t。可调成梯度，既在Tm左右的几个温度。DNA的260/280值在不在1.8-2.0之间?
xiaowo1127

引用回帖:
2楼: Originally posted by kiruwa at 2013-01-12 02:17:09
跑一个positive control,估计是你DNA提取不理想. 细菌16S rRNA是最好扩增的,退火温度多少?

你好，感谢你的帮助，我们是用试剂盒提取的，也是按照步骤来提的，也不知道提的好不好，只跑DNA检测的电泳了，感觉条带挺好的，就接着做PCR，结果P很久，也没P出来，退火温度也试了很多，大概50~55度，P的结果很不理想，请您多多指教，谢谢~~~
xiaowo1127

引用回帖:
3楼: Originally posted by weebug at 2013-01-12 08:20:40
调温度看下，annealing temp. 通常低于TM五度。若pcr有gradient功能，annea1ing t。可调成梯度，既在Tm左右的几个温度。DNA的260/280值在不在1.8-2.0之间?

你好，我们做的PCR退火温度已经设置成梯度了，可是还是P不出来，找了很多原因，还是没有好的结果，我想问一下，我们实验室没有检测DNA纯度的仪器，有没有什么好的方法检测DNA的量呢？求指教~~~~
，
55晴朗天天

用液相色谱也能测DNA浓度，DNA浓度太高的话，有时候也P不出来
xiaowo1127

引用回帖:
6楼: Originally posted by 55晴朗天天 at 2013-01-13 15:39:16
用液相色谱也能测DNA浓度，DNA浓度太高的话，有时候也P不出来

我用液相试试，如果可以的话能否借鉴一下您的PCR条件，还有您的PCR用的是什么体系，DNA通常用的量是多少，谢谢~~~
cory0931

模板存在二级结构？
二聚体多时，可以考虑适当提高退火温度；
实在不行，重新设计引物？