组氨酸标签重组蛋白纯化
用GE的1ml HisTrap HP 纯化的,binding buffer (pH7.0 25mM Tris-HCl 0.5MNaCl) 结合后,用250mM咪唑10CV线性洗脱,得到3个洗脱峰,洗脱峰1和2有交集,洗脱峰3单独的一个峰,然后超滤离心管稍微浓缩了一下跑SDS-PAGE。
1、按理说峰3应该是我的目的蛋白,可是检测酶活性峰2活性很高,峰3很微弱的活性,这是怎么回事?我哪里出错了吗?
2、后来不知道是不是柱子结合效率低了,怎么都跑不出第三个峰,检测只有穿透峰有酶活,洗脱峰没有酶活。
请各位大侠指教.....
lane1:marker lane2:破碎液 lane3:穿透峰 lane4:洗脱峰1 lane5:洗脱峰2 lane6:洗峰脱3 返回小木虫查看更多
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过柱后用低浓度的咪唑(10mM)清洗一下,再洗脱,可能蛋白会更纯些,我是用没加咪唑的Binding,然后用低浓度的清洗杂蛋白,最后用高浓度咪唑洗脱,得到的蛋白比较纯,SDS-PAGE只跑出来只有一条带
直接用250mM洗杂带肯定很多啦,可以试下先后分别用10mM,50mM,100mM,200mM,300mM,500mM咪唑洗脱,也可以用线性0~500mM咪唑洗脱,分部收集。
可能洗脱峰2中的那条粗带是你的活性目的蛋白。预测下目的蛋白的大小,你是用什么系统表达的?
你的蛋白傍柱效果很好的。穿透液都没有明显的目的蛋白。洗峰脱3理论上你的目的蛋白,我做的活性方面不多,所以不好说。在ELUTE之前,你可以用10---20mM咪唑先冲洗再拉线型,效果会好点。buffer中可以再加5%的甘油试试。
pet28a(+)载体 利用载体上N端的6个HIS 目的蛋白大概33KDa 应该下面那一个条带的啊
5%甘油的目的是什么呢?
防止蛋白间的疏水作用
buffer中可以再加5%的甘油试试。
这里的Buffer是指溶解蛋白的Buffer呢还是咪唑洗脱液中需要加甘油呢
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