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组氨酸标签重组蛋白纯化

作者 liufeifeia
来源: 小木虫 500 10 举报帖子
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用GE的1ml  HisTrap HP 纯化的,binding buffer (pH7.0  25mM Tris-HCl 0.5MNaCl) 结合后,用250mM咪唑10CV线性洗脱,得到3个洗脱峰,洗脱峰1和2有交集,洗脱峰3单独的一个峰,然后超滤离心管稍微浓缩了一下跑SDS-PAGE。
1、按理说峰3应该是我的目的蛋白,可是检测酶活性峰2活性很高,峰3很微弱的活性,这是怎么回事?我哪里出错了吗?
2、后来不知道是不是柱子结合效率低了,怎么都跑不出第三个峰,检测只有穿透峰有酶活,洗脱峰没有酶活。
请各位大侠指教.....

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  • 精华评论
  • wen1023tao

    过柱后用低浓度的咪唑(10mM)清洗一下,再洗脱,可能蛋白会更纯些,我是用没加咪唑的Binding,然后用低浓度的清洗杂蛋白,最后用高浓度咪唑洗脱,得到的蛋白比较纯,SDS-PAGE只跑出来只有一条带

  • zxc6884

    直接用250mM洗杂带肯定很多啦,可以试下先后分别用10mM,50mM,100mM,200mM,300mM,500mM咪唑洗脱,也可以用线性0~500mM咪唑洗脱,分部收集。
    可能洗脱峰2中的那条粗带是你的活性目的蛋白。预测下目的蛋白的大小,你是用什么系统表达的?

  • dshlove

    你的蛋白傍柱效果很好的。穿透液都没有明显的目的蛋白。洗峰脱3理论上你的目的蛋白,我做的活性方面不多,所以不好说。在ELUTE之前,你可以用10---20mM咪唑先冲洗再拉线型,效果会好点。buffer中可以再加5%的甘油试试。

  • liufeifeia

    引用回帖:
    : Originally posted by zxc6884 at 2012-02-27 20:24:30:
    直接用250mM洗杂带肯定很多啦,可以试下先后分别用10mM,50mM,100mM,200mM,300mM,500mM咪唑洗脱,也可以用线性0~500mM咪唑洗脱,分部收集。
    可能洗脱峰2中的那条粗带是你的活性目的蛋白。预测下目的蛋白的大小,你 ...

    pet28a(+)载体 利用载体上N端的6个HIS  目的蛋白大概33KDa  应该下面那一个条带的啊

  • liufeifeia

    引用回帖:
    : Originally posted by dshlove at 2012-03-02 11:30:51:
    你的蛋白傍柱效果很好的。穿透液都没有明显的目的蛋白。洗峰脱3理论上你的目的蛋白,我做的活性方面不多,所以不好说。在ELUTE之前,你可以用10---20mM咪唑先冲洗再拉线型,效果会好点。buffer中可以再加5%的甘油 ...

    5%甘油的目的是什么呢?

  • dshlove

    引用回帖:
    6楼: Originally posted by liufeifeia at 2012-03-06 16:06:59:
    5%甘油的目的是什么呢?

    防止蛋白间的疏水作用

  • huijhruby

    引用回帖:
    4楼: Originally posted by dshlove at 2012-03-02 11:30:51
    你的蛋白傍柱效果很好的。穿透液都没有明显的目的蛋白。洗峰脱3理论上你的目的蛋白,我做的活性方面不多,所以不好说。在ELUTE之前,你可以用10---20mM咪唑先冲洗再拉线型,效果会好点。buffer中可以再加5%的甘油试 ...

    buffer中可以再加5%的甘油试试。
    这里的Buffer是指溶解蛋白的Buffer呢还是咪唑洗脱液中需要加甘油呢

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