蛋白质纯化方法，镍柱Protocol
蛋白质纯化方法（镍柱）
柱前操作
1.IPTG诱导后，收菌，8000rpm/min(r/m)离心10min;
2.用Binding Buffer（BB）溶解（每100ml原菌液加BB 20ml),超声裂解30min（工作：5s,停止：5s)，1500r/m离心10min,去除杂质；
3.取上清，12000r/m离心20min,得包涵体；
4.用含2M尿素的BB洗包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；
5.用含6M尿素的BB溶解包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；
6.对照电泳结果，将上清或包涵体溶解液上柱；
平衡柱子（柱体积：V）
7. 3V（3倍柱体积）ddH2O(洗乙醇）；
8. 5V Charge Buffer（CB);
9. 3V BB;
柱层析
10.上样；
11. 10V Washing Buffer（WB）；
12. 6V Elute Buffer（EB);
13.分管收集，每管1~2ml.
各种缓冲液配方
1. 8×BB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 40mM imidazole(咪唑），pH=7.9
  1000ml
  NaCl: 58.44×4=233.76g
  Tris-HCl: 121.14×160×10-3=19.3824g
  Imidazole: 68.08×40×10-3=2.7232g
2. 8×CB: 400mM NiSO4
   1000ml
  NiSO4: 262.8×400×10-3=105.12g
3. 8×WB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 480mM imidazole, pH=7.9
  1000ml
  NaCl: 233.76g, Tris-HCl:19.3824g, Imidazole: 32.6784g
4. 4×EB: 2M NaCl, 80mM Tris-HCl, 4M imidazole, pH=7.9
  1000ml
  NaCl: 118.688g, Tris-HCl:9.6912g, Imidazole: 272.32g
5. 6M 尿素
  1000ml
  尿素：60.06×6=360.36g

[ Last edited by silicare on 2011-10-14 at 09:17 ]

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