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【求助/交流】重叠PCR的问题???

作者 xulanzzz
来源: 小木虫 350 7 举报帖子
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大家好,这个是重叠PCR的步骤:请问里面的第5)步的延伸都需要添加什么??
1)  以引物A/B进行PCR1;
2)  以引物C/D进行PCR2;
3)  引物B/C中引入了需要的限制性位点;
4)  混合二者PCR产物,混合以前最好回收一下;
5)  进行PCR延伸反应,1-5个循环即可。
6)  以延伸反应的产物为模板,以A/D为引物进行PCR;
7)  产物即为所需最终产物。

[ Last edited by xulanzzz on 2010-10-11 at 13:05 ] 返回小木虫查看更多

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  • 精华评论
  • jasco

    互为模板延伸,但是“只有右面”就不懂指哪个

  • hongchenlyan

    我曾经做过,是删除一段序列,设计B/C引物基本一致,跨所要删的序列,1)2)步骤一致,然后分别回收产物,大致等量混合后,以A/D为引物进行PCR获得终产物。

  • xulanzzz

    引用回帖:
    Originally posted by jasco at 2010-10-11 10:50:31:
    互为模板延伸,但是“只有右面”就不懂指哪个

    这个本来下面有一个图说明,但是图粘贴不上。请问延伸的反应要不要添加聚合酶?

  • xulanzzz

    引用回帖:
    Originally posted by hongchenlyan at 2010-10-11 11:12:48:
    我曾经做过,是删除一段序列,设计B/C引物基本一致,跨所要删的序列,1)2)步骤一致,然后分别回收产物,大致等量混合后,以A/D为引物进行PCR获得终产物。

    重叠PCR有两种做法,你说的是其中一种,即模板等量混合之后进行常规PCR,还有另一种是先进行5个循环的延伸,然后添加引物进行PCR

  • 王会征

    把混好的体系放在PCR仪里,温度调到72度不就是延伸了啊。

  • jasco

    引用回帖:
    Originally posted by xulanzzz at 2010-10-11 11:50:36:

    这个本来下面有一个图说明,但是图粘贴不上。请问延伸的反应要不要添加聚合酶?

    加!

  • sd3824289

    taq酶要加的,要看你后面做什么了,如果精确度要求很高,建议使用高保真的Taq酶,这样结果又保证!做连接测序的时候T载体要选择平末端连接的载体!

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