【求助/交流】关于基因敲除
最近在做大肠基因敲除,转化的是PCR产物,是DNA片段,2000Kb多点,转化后,平板上有菌落长出来,接摇瓶转化子也长,同样的抗生素浓度下转化前的菌株不长,这可以说明转化子表现抗性吧?但是验证PCR时,P出来的条带总是在一条线上,也就是说没有重组上,感觉很奇怪,不知道各位有没有遇到这种情况,这到底是什么原因,转化进去片段应该不会表达的吧?不知道我有没有把问题说清楚,请高手指教!!先谢过了!! 返回小木虫查看更多
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最近在做大肠基因敲除,转化的是PCR产物,是DNA片段,2000Kb多点,转化后,平板上有菌落长出来,接摇瓶转化子也长,同样的抗生素浓度下转化前的菌株不长,这可以说明转化子表现抗性吧?但是验证PCR时,P出来的条带总是在一条线上,也就是说没有重组上,感觉很奇怪,不知道各位有没有遇到这种情况,这到底是什么原因,转化进去片段应该不会表达的吧?不知道我有没有把问题说清楚,请高手指教!!先谢过了!! 返回小木虫查看更多
也遇到同样的问题啊,做酵母基因敲除,转进了抗性基因,能耐受很高的抗生素浓度,PCR验证却做不出来。
做酶切验证,那是最准确的方法。另外,你PCR时应该做阳性对照,以验证是否是PCR的问题
PCR我做了一个未转化菌株的对照,P出来的条带和转化子P出的条带在在一条带上,我点样时加了一个Marker,结果是全部都没有到2000K,这个应该可以说明PCR没有问题的吧
,
你的pcr片段大小是不是和你要敲除的基因片段大小差不多?
不是的,,我是拿菌的全基因P的,这肯定不一样大的吧……
lz问题解决了没?我也遇到这样的问题了。。。
具体的比对一下你的基因片段大小和PCR产物的大小是否差不多吧,有的时候大小差别很少的。
也可以在你PCR产物的中间设计一个引物,这样做PCR的话,只有阳性的菌落才能P出来。